有時，流動相中的強溶劑成分不能完全除去色譜柱中的汙染物。必須使用更強的溶劑或壹系列溶劑來清洗色譜柱。如果汙染物是非生物的，用戶可以通過壹種或多種其他有機溶劑去除不需要的化合物。可以使用多種溶劑和溶劑組合。訪問壹些色譜柱制造商的網站，瀏覽壹些推薦的溶劑系統。
壹般來說，所有的清潔都會遵循類似的模式。清洗過程中溶劑濃度增加，通常最後會使用壹些非極性溶劑(如乙酸乙酯，甚至碳氫化合物)，這將有助於溶解壹些脂類和油類化合物。重要的是要確保該系列中的每種溶劑都與下壹種使用的溶劑混溶。清洗循環的結論是，在返回初始流動相系統之前，它可以被中間互溶溶劑逆轉。例如，異丙醇是該中間步驟的優良溶劑，因為它可與有機溶劑如正己烷和二氯甲烷混溶，並且它也可與水性溶劑混溶。因為異丙醇的粘度很大，所以清洗時要保證流速不要太高，否則泵的壓力會過載。同樣，如果使用紫外檢測器，必須避免使用在紫外光譜區吸收的溶劑，因為需要大量的清洗溶劑來去除所有吸收的溶劑，以獲得穩定的基線。不含緩沖液的典型鍵合矽膠色譜柱和流動相的推薦清洗系統為:
L100%甲醇；
L 100% B眼；
L 75%第二眼-25%異丙醇；
L100%異丙醇；
L100%二氯甲烷；
L100%正己烷；
當使用二氯甲烷或正己烷作為洗滌溶劑時，由於溶劑的不相容性，在使用含水的流動相之前，需要用異丙醇洗滌色譜柱。用於清洗色譜柱的清洗溶劑的體積至少應為色譜柱體積的10倍。對於250mm×4.6mm的色譜柱，分析人員可以使用1 ~ 2 ml/min的經典HPLC流速。為了回到最初的流動相，色譜工作者可以跳過顛倒使用這壹系列清潔劑。建議使用異丙醇作為中間清洗溶劑，然後用不含緩沖液的流動相沖洗，最後用原流動相沖洗。四氫呋喃是另壹種廣泛使用的溶劑，可用於清洗被汙染的色譜柱。如果用戶懷疑色譜柱被嚴重汙染，可以用二甲基亞碸或二甲基甲酰胺與水按50: 50的比例清洗，流速小於0.5mL/min。反相液相色譜柱的成功再生需要相當長的時間，用溶劑清洗可以為過夜操作建立梯度程序。*
清洗過程中，出現了色譜柱是否要倒洗的問題。因為大部分強截留汙染物會停留在色譜柱的前端，所以倒著清洗色譜柱會減少溶解汙染物流出色譜柱的遷移距離。就填充層的穩定性而言，大多數現代高效液相色譜柱的填充壓力遠高於普通操作壓力；因此，色譜柱的填充層不應受到反向流速的幹擾。但如果色譜柱頂部篩板的縫隙比底部大，這種反過來的方式是有害的。例如，如果底部篩板的間隙為2？m，足以容納平均粒徑為5？m’s色譜柱(含粒徑5 2？m)的尺寸分布。但廠家往往在色譜柱頂部安裝孔隙率較大的篩板，以防止被樣品或流動相顆粒堵塞。如果這個篩板的孔隙率大於粒徑分布中最小的顆粒，部分填料會通過篩板流出色譜柱，產生中空。如果色譜柱上有壹個箭頭提醒色譜柱的流向，我覺得在反向使用色譜柱之前，應該參考使用說明書，瀏覽廠家網站或者和技術支持組討論，確定這是否是安全之舉。無論妳是否反向使用色譜柱，最好將色譜柱與HPLC檢測器斷開，這樣汙染物或顆粒會停留在篩板上而不會流過檢測池，因為這些物質會汙染檢測池。
清洗被汙染的反相色譜柱的頻率取決於柱內註入了多少未知物質，因為反相色譜柱在分辨率損失和外來物質洗脫之前，有時可以容忍大量的汙染物，用戶往往要等到觀察到壹些異常現象後才清洗色譜柱。但汙染物長時間積累，會增加色譜柱清洗的難度。正因為如此，如果妳知道妳的色譜柱容易被臟的樣品基質汙染，我建議定期清洗妳的色譜柱。清洗次數越多，清洗條件越簡單。
反相矽膠基質色譜柱中殘留蛋白質的清除
如果壹些生物物質如血漿和血清殘留在反相液相色譜柱上，色譜工作者必須使用壹些不同的清洗程序。大多數情況下，壹些相對純的有機試劑，如乙酸乙酯或甲醇，不能溶解多肽和蛋白質，因此不能有效清洗反相液相色譜柱。然而，混合有機溶劑與緩沖液，酸或壹些離子對試劑可以有效地清洗這些物質。最初，可以嘗試用含有相對高濃度溶劑b的流動相清洗色譜柱。
Freiser和他的同事(4)發現，被汙染的反相液相色譜柱可以通過重復梯度洗脫和使用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸-正丁醇來再生。Bhadway和Day(5)建議註入100？l三氟乙醇至250mm×4.6mm色譜柱即可達到清洗的目的。如果所有這些方案都失敗了，建議使用庫尼科和他的同事的強洗脫劑和可溶性試劑(6)(見表3)。但是，在用這些試劑清洗色譜柱之前，妳應該查閱色譜柱的說明書或向制造商咨詢，以確保它不會損壞色譜柱的填料。矽鍵合色譜柱的填料往往可以與這些試劑同時存在，而聚合物色譜柱則可能因為與特定的溶劑結合而膨脹或收縮，從而影響色譜柱的性能。
表3 HPLC反相色譜柱去除蛋白質物質所用的清洗溶劑
溶劑成分
乙酸1%水溶液
三氟乙酸1%水溶液
0.1%三氟乙酸-異丙醇40: 60(體積比)(粘稠，通常會降低流速)
TEA-異丙醇40: 60 (v: v)(在混合三乙胺之前，用0.25N磷酸將pH調節至2.5)。
尿素或胍的5-8M水溶液(調節pH值至6-8)
0.5-1.0m氯化鈉、Na2PO4和Na2SO4水溶液(Na2PO4 pH 7.0)
DMSO-水或DMF-水50: 50(體積比)
來自參考文獻6。
如果使用早期系列的溶劑，有必要確保表3中的溶劑與該系列的溶劑互溶。異丙醇是壹種很好的中間洗滌溶劑。系統中的清洗體積至少是20個柱體積。因為某些溶劑清洗系統具有壹定的粘度，所以必須調節沖洗流量，以避免超壓。清洗含有胍和尿素的色譜柱後，必須用至少40 ~ 50倍柱體積的色譜級水沖洗。
不適宜使用某些清洗劑，如十二烷基磺酸鈉(SDS)、曲拉通等清洗反相高效液相色譜柱，因為這些化合物會強烈吸附在矽膠基質表面，難以去除。這些試劑會影響填料的表層，改變填料的性質。但分離團隊的研究發現，肽合成過程中保護基和純化劑對色譜柱的汙染，可以通過註入500？用1% SDS溶液以1毫升/分鐘的流速洗滌l(7)。如果使用含0.1% (v/v)三氟乙酸的5% ~ 95%乙基眼的梯度，並在初始條件下進行平衡，可以恢復多肽的分離效果。