瀏覽次數： 47? 日期： 2017-05-24 15:17:02
多肽類化合物廣泛存在於自然界中，其中對具有壹定生物學活性的多肽的研究，壹直是藥物開發的壹個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。壹些新方法、新思路的應用，不斷有新的肽類物質被發現應用於防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
分離方法
采取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沈澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到壹起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、電泳等。
1、 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其他化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1)? 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得壹系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間。而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，並利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析(Peptide Mapping):肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專壹性較強的蛋白水解酶［壹般為肽鏈內切酶（endopeptidase)］作用於特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過壹定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜。肽圖分析對多肽結構研究和特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用於Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法采用C18柱檢測了重組人生長激素（rhGH）的肽片斷，成功獲得了人生長激素特征性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專壹裂解也制得，並可鑒別僅相差壹個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便於鑒定分析。此項技術已經在新藥開發中得到廣泛應用。
2)? 疏水作用色譜(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)
HIC是利用多肽中含有疏水基團，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-HPLC具有較少使多肽變性的特點。利用HIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比RP-HPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組幹擾素-γ，通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這壹要求。
3)? 分子排阻色譜(Size-Exclusion chromatography，SEC)
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對壹些較大的聚集態的分子更為方便。如人重組生長激素（hGH)的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上的分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體。利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEG具有半衰期長、作用強的特點。壹些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
4)? 離子交換色譜(Iron-Exchange chromatography，IEXC)
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有壹些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐酶異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今後此類物質分離研究。
5)? 膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein，CMP)
CMP+分離強疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統，壹般有去垢劑（如，SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融膜蛋白，並由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定於膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合後在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
6)? 高效置換色譜(High-Performance Displacement Chromatography，HPDC)
HPDC是利用小分子的高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低於總量1％組分的活性人重組生長激素(rHG)。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡聚糖(Detran Sulfate，DS)是對β-乳球蛋白A和B的良好置換劑，壹般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易於與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
7)? 灌註層析(Perfusion Chromatography，PC)
PC是壹種基於分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合於不同分子量的多肽分離使用。
2、 親和層析(Affinity Chromatography，AC)
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親合性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如，抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基有天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用壹系列親合柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)是近年來發展起來的壹種親和方法。其固定相基質上鰲合了壹些金屬離子，如，Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子(Insulin-Like Growth Factor,IGF)、二氫葉酸還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另壹種親和層析方法，利用反義多肽作為配基，這種多肽是由反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有壹定的親和性，如，Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
3、 毛細管電泳(Capillary electrophoresis，CE)――分離分析方法：
CE是在傳統的電泳技術基礎上於本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳(Capillary Zone electrophoresis，CZE)、毛細管等電聚焦電泳(Capillary Isoeletric Focusing，CIEF)、毛細管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)和膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography，MECC)等。
1)? 毛細管區帶電泳(Capillary Zone electrophoresis，CZE)
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電荷不同，且分離效果只由帶電性決定，比傳統凝膠電泳更準確。目前存在於CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛吸管矽膠柱上的矽醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如，調節電泳液的pH值，使與矽醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同采取不同的CZE柱來分離。Issaq等利用CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低pH條件下，緩沖液中含有壹定濃度的金屬離子，如，Zn2＋等，此時分離速度快而且準確。
2)? 毛細管等電聚焦電泳(Capillary Isoeletric Focusing，CIEF)
由於不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沈澱下來，而與其他肽分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由於在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
3)? 毛細管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)
CGE是基於分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有壹種非交聯、線性、疏水多聚凝膠柱被用於多肽類物質的分離分析，此電泳法適於含疏水側鏈較多的肽分離。這種凝膠易於灌註，使用壽命長，性質較為穩定。
4)? 膠束電動毛細管層析(Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography，MECC)
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如，SDS，使壹些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對壹些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有壹定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
4、 多肽及蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，采用不同的分離手段。特別是在後基因組時代，對於蛋白質組深入的研究，人們對於分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，采用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術是實現蛋白質組計劃的關鍵。其中電泳技術在此項研究中即是分離手段也是分析方法之壹。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
分析方法
1、 質譜分析(Mass Spectrometry，MS)
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化後的在線分析中，MS的高靈敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment，cf-FAB)和電霧離子化質譜(Electrospray Ionization，EIS)是近幾年發展起來的新方法。
1)? 連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment，cf-FAB）
cf-FAB是壹種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH＋或（M-H）形式。主要應用於肽類的分離檢測，其具有中等分辨率，精確度大於±0.2amu，流速壹般在0.5-15μl?mL-1。在測定使流動相需加0.5％～10％基質，如，甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離、分析目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，並得到很好的應用，如，Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性，連接分子方面具有重要意義。
2)? 電霧離子化質譜(Electrospray Ionization，EIS)
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105的蛋白進行分析，分辨率在1500～2000amu,精確度在0.01％左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
3)? 基質輔助激光解析／離子化——飛行時間質譜(Matrix-associated laser? dissociation/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定相對分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和分辨率均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2、 核磁***振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊範圍過寬（由於相對分子質量太大）和信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用壹直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之壹。NMR可用於確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用於蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便於定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速準確分析的目的。
3、 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用於多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽類物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷湧現，因此這壹領域的研究具有廣闊的前景