藥物敏感試驗介紹
抗生素在控制細菌感染性疾病中起著非常重要的作用。然而，由於在養殖過程中抗生素的不科學和盲目濫用，許多病原菌產生了抗藥性，使得抗生素對細菌性疾病的防治效果越來越差，不僅造成藥物浪費，還延誤了病情，給養殖戶造成了很大的經濟損失。隨著新病原菌的出現，抗菌藥物的防治效果越來越差。而且各種致病菌對不同的抗菌藥物有不同的敏感性，同壹細菌的不同菌株對不同的抗菌藥物也有不同的敏感性。長期以來，各種致病菌耐藥性的出現，往往使各種常用抗菌藥物失去療效，藥物對細菌的敏感性不能很好的把握，因此壹個正確的結果可以作為臨床醫生選擇抗菌藥物和提高療效的參考。這就需要利用藥敏實驗來確定藥物敏感性，以便準確有效地使用藥物進行治療。但由於藥敏試驗要求嚴格，條件高，只能在大專院校或科研單位操作，部分養殖廠或部分門診很難操作藥敏試驗。為了解決這壹問題，農業部動物檢疫所青島億邦生物工程有限公司動物疫病診療中心經過幾年的總結和實踐，逐步總結出了幾套適合基層進行藥敏試驗的操作方法，現簡要介紹如下。
[編輯本段]藥物敏感性試驗的分類
目前臨床微生物實驗室的藥敏試驗方法主要有紙片擴散法、稀釋法(包括瓊脂和肉湯稀釋法)、抗生素濃度梯度法(E-test法)、自動化儀器等。
壹、紙張擴散法
這種方法是在接種了試驗菌的瓊脂表面粘貼壹張含有定量抗菌藥物的濾紙，紙中的藥物在瓊脂中擴散。隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數下降，從而在紙張周圍形成濃度梯度。同時，紙張周圍抑菌濃度範圍內的菌株不能生長，第二抑菌範圍外的菌株可以生長，從而在紙張周圍形成壹個透明的抑菌圈。不同抑菌藥物的抑菌圈直徑可能因藥物在瓊脂中的擴散速度而不同。抑菌圈的大小可以反映試驗菌對藥物的敏感性，與藥物對試驗菌的MIC呈負相關。
二、稀釋法
稀釋藥敏試驗可用於定量檢測抗菌藥物對某種細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。在實驗中，抗菌藥物的濃度通常被稀釋倍(lg2)，能使待測細菌肉眼生長的最低藥物濃度成為最低抑菌濃度(MIC)。特定抗菌藥物的檢測濃度範圍應包括能檢測出細菌的解釋性拐點(敏感性、中間性和耐藥性)的濃度，還應包括MIC。2.1瓊脂稀釋法用於參考菌株的質量控制。首先，準備含有抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。接種待測菌株，然後解讀結果。2.2肉湯稀釋法
三、抗生素濃度梯度法
四、自動儀器法
實驗步驟
壹、實驗材料
普通營養瓊脂培養基:可以從生化試劑商店購買，不同細菌的藥敏試驗可以選擇不同的培養基。比如可以選擇普通營養瓊脂或麥富凱培養基進行大腸桿菌的藥敏試驗。沙門氏菌可選用血清培養基。藥敏試紙:購買或自制(詳見實驗準備)細菌:需做藥敏試驗的細菌儀器:接種環、酒精燈、穿孔器、牛津杯、移液管、發射器。
二、實驗準備
2.1藥敏片制備:購買或自制2.1.1制備方法:取新華1定性濾紙，用打孔機打成直徑為6 mm的圓形小紙片。取50張圓形紙放入幹凈幹燥的空青黴素瓶中，用單層牛皮紙包裹瓶口。在15磅壓力下高壓滅菌後。15-20分鐘，放入37℃培養箱或烤箱中數天，使其完全幹燥。2.1.2抗菌紙的制備:在裝有50張紙的青黴素瓶中加入0.25ml藥液，翻轉紙張，使每張紙都被藥液充分浸透。翻動紙張時，紙張不能被搗碎。同時在瓶口記下藥品名稱，放入37℃培養箱過夜，晾幹後蓋好蓋子。如果可能的話，可以真空幹燥。不要受潮，儲存在黑暗幹燥的地方，有效期為3-6個月。2.2藥液的配制(用於市售藥品的試驗):按市售藥品的治療劑量比例配制藥液；比如市售藥品白冰消，可以按規定量處理0.01%的飲用水，按此比例配制藥液。可將10毫克加入10毫升水中，混合均勻。這種稀釋液是用於藥敏試驗的藥液。
三、實驗操作方法
3.1藥敏片法3.1.1在“超凈臺”中，用火焰(酒精燈)滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，用劃線法將細菌塗於培養皿培養基上。具體方式；用無菌接種環取適量細菌分別塗於培養皿邊緣的四個點上，從每個點到培養皿的1/2標記細菌。然後，找到第二條虛線到平板的1/2，依次劃線，直到細菌均勻分布在平板上。(另外，可選擇待測菌，在少量生理鹽水中制成菌懸液，用無菌棉簽將待測菌懸液塗於平板培養基表面。要求塗層均勻致密)3.1.2酒精燈火焰滅菌後停止鑷子，取藥敏片貼於平板培養基表面。為了使藥敏片緊密貼在培養基上，可以用鑷子輕輕按壓藥敏片。為了準確觀察結果，要求藥敏片能有規律地分布在平板培養基上；壹般可以在菜的中心貼壹片，在外圍等距離貼幾片(外圍可以貼七片)。記住每片藥敏片的名字。3.1.3將培養皿培養基放入37℃培養箱中24小時，觀察效果。3.2牛津杯3.2.1在“超凈臺”中，用火焰(酒精燈)滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，用劃線法將細菌塗於培養皿培養基上。具體方式；用無菌接種環取適量細菌分別塗於培養皿邊緣的四個點上，從每個點到培養皿的1/2標記細菌。然後，找到第二條虛線到平板的1/2，依次劃線，直到細菌均勻分布在平板上。(另外，可選擇待測菌，在少量生理鹽水中制成菌懸液，用無菌棉簽將待測菌懸液塗於平板培養基表面。要求塗層均勻致密。)3.2.2將已滅菌的不銹鋼細管(內徑6nm，外徑8nm，高65438±00n m的圓形細管，兩端應光滑，也可使用玻璃管和瓷管)置於培養基上，輕輕按壓使其與培養基無間隙接觸，細管上標明各種藥物的名稱。每個平板可以容納4-6個小管。等分鐘後，在每個小試管中滴入壹定量的各種藥液，防止溢出。在37℃培養8-18小時，觀察結果。3.2.3將培養皿培養基置於37℃培養箱中24小時，觀察效果。3.3打孔法:該方法簡單，成本低，易操作，適用於商品藥品的檢測。3.3.1在“超凈臺”中，用火焰(酒精燈)滅菌的接種環選擇適量的細菌培養物，用劃線法將細菌塗布在培養皿培養基上。具體方式；用無菌接種環取適量細菌分別塗於培養皿邊緣的四個點上，從每個點到培養皿的1/2標記細菌。然後，找到第二條虛線到平板的1/2，依次劃線，直到細菌均勻分布在平板上。(另外，可選擇待測菌，在少量生理鹽水中制成菌懸液，用無菌棉簽將待測菌懸液塗於平板培養基表面。要求塗層均勻致密。3.3.2將不銹鋼小管(外徑4 mm，孔徑、孔距3 mm，兩端要光滑，玻璃管、瓷管也可)滅菌後放在培養基上打孔，用針挑出孔中的培養基，用火焰封底，使培養基與平板充分融合(防止液體外漏，影響結果)。3.3.3加樣:根據不同藥液加入樣品，直至樣品充滿但不溢出。3.3.4將培養皿培養基置於37℃培養箱中24小時，觀察效果。
結果觀察
在塗有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂周圍擴散，其濃度逐漸降低，從而抑制了紙張周圍壹定距離內細菌的生長。過夜培養後，形成抑菌圈。抑菌圈越大，菌株對這種藥物的敏感性越大；否則越小。如果沒有抑菌圈，說明菌株對這種藥物有耐藥性。其直徑與藥物濃度和劃線菌濃度直接相關。
標準
壹、藥敏試驗結果應以抑菌圈直徑為標準判斷敏感性。表1藥物敏感性試驗確定的敏感性標準抑菌圈直徑(mm)
20以上極度敏感
15~20高靈敏度
10~14鐘敏
低於10的低靈敏度
0不敏感
2.藥敏試驗標準見表1，多粘菌素抑菌圈；9 mm以上為高敏感，6-9 mm為低敏感，無抑菌圈為不敏感。
影響藥敏結果的因素
1.培養基:應根據試驗菌的營養需要進行配制。澆註板材時，厚度要合適(5-6mm左右)，但不能太薄。壹般以將18-20ml培養基倒入直徑為90mm的培養皿中為宜。培養基中應避免使用抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子，可降低氨基糖苷類的抗菌活性，而胸苷和對氨基苯甲酸(PABA)可拮抗磺胺類和TMP的活性。二、細菌接種量:細菌接種量要恒定。如果太多，抑菌圈會變小，能產生酶的菌株會破壞藥物的抗菌活性。三、藥物濃度:藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需要準確配制。市售藥品應嚴格按照其推薦的治療劑量配制。4.培養時間:壹般培養溫度和時間為37℃ 8-18小時，部分抗菌藥物如多粘菌素擴散緩慢。可以將裝有抗菌藥物的平板培養基放入4℃冰箱中2-4小時，使抗菌藥物預擴散，再放入37℃培養箱中培養，可以延緩細菌的生長，得到更大的抑菌圈。
[編輯本段]藥物敏感性試驗的應用
藥敏試驗後，應選擇高度敏感的藥物進行治療，或選擇兩種藥物幫助減少耐藥菌株。在選擇高敏感藥物時，要考慮藥物的吸收途徑，因為我們的藥敏實驗是液體直接接觸細菌，給鳥類用藥時，藥物必須被機體吸收才能達到壹定的效果。因此，在給鳥類用藥時，高度敏感的藥物必須結合適當的給藥方法，才能達到良好的治療效果。
參考資料:/view/611389.htm？fr=ala0_1_1