二、滅菌
滅菌是組織培養的重要工作之壹。初學者應該清楚細菌和無菌的範圍。細菌的範圍是：壹切暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少其表面是有細菌的。根據這壹觀點，未經處理的場所，如無菌室、超凈工作臺的表面、簡單煮沸的培養基、我們使用的未經處理的刀剪、我們身體的整個外表面和與外界相通的內表面，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體，以及培養容器，無論清洗得多麽幹凈等，都是有細菌的。這裏所說的細菌包括細菌、真菌、放線菌、藻類和其他微生物。細菌的特點是極其微小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下經久不衰，生活條件要求簡單，繁殖能力強，條件適宜時可大量繁殖。無菌的範圍是：經過高溫灼燒或壹定時間蒸煮後的物體，經其他物理或化學方法滅菌處理後的物體（當然，這些方法必須經過實踐證明是有效的），高層大氣、巖石內部，健康的動物、植物，以及未與外界接觸的內部組織，強酸、強堿、滅菌劑等化學元素的表面和內部都是無菌的。由此可見：在地球表面，無菌世界比有菌世界要小得多。滅菌是指使用物理或化學方法殺死物體表面和孔隙內的所有微生物或生物，即殺死所有生物。與此相關的壹個概念是消毒，指的是殺死、消除或充分抑制某些微生物，使其不再產生有害作用。顯然，消毒後，許多細菌孢子、黴菌厚壁孢子等並不會被完全殺死，即因為在消毒後的環境中和物品上仍有活的微生物，所以通過對操作空間（接種、超凈工作臺等）和使用的器皿進行嚴格消毒，操作者的 操作空間（接種、超凈工作臺等）和使用的器皿以及操作者的衣服和手都沒有活的微生物。在這種條件下進行的操作稱為無菌操作。植物組織培養對無菌條件的要求非常嚴格，甚至超過了微生物培養的要求，因為培養基中含有豐富的營養物質，稍有不慎就會造成雜菌汙染。要達到徹底滅菌的目的，必須根據不同的對象采取不同的切實有效的滅菌方法，才能保證培養物不受雜菌的影響，使試管苗能夠正常生長。常用的滅菌方法可分為物理和化學兩大類，即物理方法有幹熱（烘烤和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法有使用硫酸、甲醛、雙氧水、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精等化學藥劑處理。這些方法和藥劑應根據不同材料的不同用途進行適當的工作。1、培養基用濕熱滅菌培養基在配制完成 24 小時後進行滅菌處理。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，蒸汽不能外溢，壓力不斷升高，使水的沸點不斷升高，使鍋內溫度也隨之升高。在 0.1MPa 的壓力下，鍋內溫度達到 121℃。在這種蒸汽溫度下，各種細菌及其耐熱性極強的孢子會很快被殺死。註意要完全排除鍋內空氣，使鍋內全是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓蒸汽滅菌器放氣有幾種不同的做法，但目的都是為了排出空氣，使鍋內均勻受熱，保證滅菌徹底。常用的方法是：關閉放氣閥，通電，當壓力升至 0.05MPa 時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零後，再關閉放氣閥。關閥後再次通電，當壓力表指針升至 0.1MPa 時，開始計時，維持壓力 0.1-0.15MPa 20 分鐘。根據容器大小不同，保壓時間也不同，見表。表中所列數字是徹底殺菌很保險的數字，如果容器體積大，但放置的數量少，也可以縮短時間。
三、接種
接種因為有壹個開放的過程，所以很容易造成汙染的時期，這個時期主要是空氣中的細菌和工作人員本身造成的，接種室要進行嚴格的空間消毒。接種室應定期用 1%-3%的高錳酸鉀溶液清洗設備、墻壁和地面，以保持接種室的衛生。除使用前用紫外線和甲醛消毒外，使用過程中可噴灑 70%的酒精或 3%的來蘇水，以沈降空氣中的塵埃粒子。無菌操作可按以下步驟進行：(1）接種前 4 小時用甲醛熏蒸接種室，並打開紫外線燈進行滅菌；（2）接種前 20 分鐘，打開超凈工作臺的風扇和臺上的紫外線燈；（3）接種人員洗手，在緩沖間換上專用實驗服，換上拖鞋等。(4) 上工作臺後，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲。(5）用酒精棉球擦拭接種工具，然後將鑷子、剪刀從頭到尾火燒，再反復火燒尖端，培養皿要火燒幹；（6）接種時，接種人員手不能離開工作臺，不能說話、走路、咳嗽等。7）接種後要清理工作臺，可用紫外線燈消毒 30 分鐘，如連續接種，每 5 天要集中消毒壹次。(7) 接種後，應將工作臺清理幹凈，並用紫外線燈滅菌 30 分鐘。接種是將已滅菌的根、莖、葉等離體器官，通過剪切或裁剪成小段或小塊，放入培養基中的過程。接種前後的程序將以連貫的方式進行描述。無菌接種的步驟：（1）將初步洗凈切好的材料放入燒杯中，拿到超凈臺上，用消毒劑消毒，再用無菌水沖洗，最後瀝幹水分，取出放在滅菌紗布或濾紙上。(2) 材料瀝幹後，壹手拿鑷子，壹手拿剪刀或手術刀，對材料進行適當的剪切。例如，葉片剪成 0.5 厘米見方的小片；莖剪成含有壹個節的小段。小莖尖應剝成只含 1-2 片嫩葉的莖尖大小等。接種過程中應經常灼燒接種器械，以防交叉感染。(3) 用灼燒過的器械將切下的外植體插入或置於培養基上。具體操作過程（以試管為例）為：先解開管口紙，將試管幾乎水平握住，使試管口緊貼酒精燈火焰，並在火焰上方旋轉管口，使管口內外灼燒數秒。如果管口被棉塞覆蓋，則先燒灼管口外側，取下棉塞，再燒灼管口內側。然後用鑷子夾取壹片切下的外植體，送入試管中，輕輕插入培養基上。如果葉片直接附著在培養基上，則以放置 1-3 片為宜。至於材料的放置方法，除莖尖和莖段要正放（尖向上）外，尚無統壹要求。接種後，管口在火焰上再燒灼幾秒種。並用棉塞塞好，用口紙包好，口紙裏面也要過火。
四、培養
培養是指培養材料在培養室內（光照、溫度條件、無菌），使其生長、分裂和分化，形成愈傷組織或進壹步分化成再生植株的過程。1、培養方法 （1）固體培養法 即用瓊脂固化培養基培養植物材料。這是目前最常用的方法。該方法雖然設備簡單，易於實施，但養分分布不均勻，生長速度不均衡，常發生褐變中毒現象。(2）液體栽培法 這是壹種不加固化劑的液體培養基栽培植物材料的方法。由於液體中氧氣含量低，通常需要通過攪拌或振動培養液來保證氧氣的供應，采用往復式振動器或旋轉式振動器進行培養，轉速壹般為 50-100r/min，這種常規的浸沒法，既能使培養基均勻，又能保證氧氣的供應。