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怎麽防止PCR實驗室汙染

PCR實驗室汙染

標本間交叉汙染:標本汙染主要有收集標本的容器被汙染,或標本放置時,由於密封不嚴溢於容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉汙染;標本核酸模板在提取過程中,由於吸樣槍汙染導致標本間汙染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的汙染。

PCR試劑的汙染:主要是由於在PCR試劑配制過程中,由於加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板汙染。

PCR擴增產物汙染:這是PCR反應中最主要最常見的汙染問題。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高於PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物汙染,就可造成假陽就可形成假陽性。

還有壹種容易忽視,最可能造成PCR產物汙染的形式是氣溶膠汙染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時及汙染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而汙染。

實驗室中克隆質粒的汙染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見,因為克隆質粒在單位容積內含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內的質粒,由於活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,其汙染可能性也很大。

汙染監測

壹個好的實驗室,要時刻註意汙染的監測,考慮有無汙染是什麽原因造成的汙染,以便采取措施,防止和消除汙染。

對照試驗

1、陽性對照:在建立PCR反應實驗室及壹般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照,它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的壹個重要的參考標誌。

2、陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定後的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,以監測試劑是否汙染。

3、重復性試驗

4、選擇不同區域的引物進行PCR擴增

防止汙染的方法

進行PCR操作時,操作人員應該嚴格遵守壹些操作規程,最大程度地降低可能出現的PCR汙染或杜絕汙染的出現。

劃分操作區:目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實現完全閉管操作,但無論是否能夠達到單人單管,均要求實驗操作在三個不同的區域內進行,PCR的前處理和後處理要在不同的隔離區內進行:

1. 試劑準備區。

2.標本制備區。

3. PCR擴增區及分析區。

切記:任何壹間的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。

分裝試劑:PCR擴增所需要的試劑均應在生物安全櫃、裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放於其中,不能用來吸取擴增後的DNA和其他來源的DNA:

1.PCR用水應為高壓的雙蒸水;

2.引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制;

3.引物和dNTP應分裝儲存,分裝時應標明時間,以備發生汙染時查找原因。

實驗操作註意事項

盡管擴增序列的殘留汙染大部分是假陽性反應的原因,樣品間的交叉汙染也是原因之壹。因此,不僅要在進行擴增反應是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該註意:

1. 戴壹次性手套,若不小心濺上反應液,立即更換手套;

2. 使用壹次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露於空氣中,避免氣溶膠的汙染;

3. 避免反應液飛濺,打開反應管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面;

4. 操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然後分裝,這樣即可以減少操作,避免汙染,又可以增加反應的精確度;

5. 最後加入反應模板,加入後蓋緊反應管;

6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應的可靠性,又可以協助判斷擴增系統的可信性;

7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的汙染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區;

8. 重復實驗,驗證結果,慎下結論

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