巴斯德的名氣非常大，他收到了許多教授的聘書，還成為了榮譽軍團的成員。雖然他是在化學領域成名的，但他在微生物學領域的偉大成就才是他成名的原因。
1854 年 9 月，法國教育部任命巴斯德為裏爾工學院院長兼化學系主任，他對酒精工業產生了濃厚的興趣，而酒精生產的壹個重要過程就是發酵。當時，裏爾壹家酒精制造廠遇到技術難題，請求巴斯德幫助研究發酵過程，巴斯德深入工廠考察，將各種甜菜汁和發酵液帶回實驗室觀察。經過多次實驗，他發現發酵液中有壹個比酵母小得多的球形體，它長大後就是酵母。
過了不久，在菌體上長出芽，芽長大後脫落，又變成新的球形體，在這個循環過程中，甜菜汁就 "發酵 "了。巴斯德繼續研究，弄清了發酵過程中產生的酒精和二氧化碳氣體是酵母分解糖分產生的。這個過程即使在沒有氧氣的情況下也能發生，他認為發酵就是酵母的無氧呼吸，控制它們的生存條件，這是釀酒的關鍵壹環。
巴斯德弄清了發酵的奧秘，從此，巴斯德終於成為偉大的微生物學家和微生物學的奠基人。
1865年，裏爾壹家釀酒廠的老板請巴斯德幫忙腌制啤酒，看看他是否能添加壹種化學物質來阻止啤酒變酸。
巴斯德答應研究這個問題，他在顯微鏡下觀察，發現未經改變的陳年葡萄酒和啤酒，液體中有壹種圓球狀的酵母細胞，當葡萄酒和啤酒變酸時，液體中有壹種細細的像棒狀的乳酸菌，正是這種 "壞蛋 "在營養豐富的啤酒中繁殖，使啤酒 "生病"。正是這個 "壞蛋 "在營養豐富的啤酒中繁殖，讓啤酒 "生病 "了。他把密閉的酒瓶放在鐵絲籃中，浸泡在加熱到不同溫度的水中，想方設法殺死乳酸桿菌，但又不能把啤酒煮沸，經過反復試驗，他終於找到了壹個簡單有效的方法：只要把酒放在五六十攝氏度的環境中，保持半個小時，就可以殺死酒中的乳酸桿菌，這就是著名的 "巴氏殺菌法"。這就是著名的 "巴氏殺菌法"，這種方法沿用至今，市場上銷售的滅菌奶就是用這種方法殺菌的。
當時，酒廠老板不相信巴斯德的做法，巴斯德不急不惱，他把壹部分樣品加熱，另壹部分樣品不加熱，並告訴老板耐心等待幾個月，結果加熱的樣品打開後酒味純正，不加熱的已經發酸。
當巴斯德成為法國的傳奇人物時，法國南部的養蠶業正面臨危機，壹種疾病導致蠶大量死亡，使南部的調絲業受到重創，人們向巴斯德求助，巴斯德的老師大仲馬鼓勵他挑起重擔。
"可我從來沒有和蠶打過交道啊！"巴斯德不肯定地說。
"那不是更好嗎？老師杜馬鼓勵他說。
當巴斯德想到法國每年因養蠶業損失壹億法郎時，他不再猶豫了，作為科學家，他有責任拯救瀕臨毀滅的法國養蠶業。巴斯德接受了農業部長的委托，於1865年只身前往法國南部的蠶桑重災區阿爾勒。
養蠶是壹種神秘的疾病，人們看了心裏很不舒服，壹生病蠶常常擡起頭，伸出腳像貓爪壹樣抓人；蠶身上布滿了棕黑色的斑點，好像粘滿了辣椒。人們大多稱這種病為 "花椒病"，病蠶有的孵出後不久就死了，有的掙紮著活到3齡、4齡也無法存活，最終難逃壹死。成繭的蠶很少，但鉆出來的蠶蛾卻殘缺不全，它們的後代也都是病蠶。當地的蠶農想盡了辦法，仍然無法治愈蠶病。
巴斯德用顯微鏡觀察，發現了壹種很小的、橢圓形的褐色顆粒，它就是感染了蠶病的蠶蛾以及餵養蠶的桑葉，巴斯德強調，所有被感染的蠶和被汙染的食物都必須銷毀，必須把康氏蠶從頭摳出來。為了證明 "胡椒病 "的傳染性，他在桑葉上刷上了致病顆粒，健康的蠶吃了這些顆粒，馬上就感染了這種病。他還指出，把蠶放在蠶架上面的格子裏的病原體，可以通過落下的糞便傳染給下面格子裏的蠶。
巴斯德還發現了蠶的另壹種疾病--腸管病。引起這種病的細菌寄生在蠶的腸管裏，會導致整條蠶發黑死亡，蠶體像氣囊壹樣柔軟，很容易腐爛。
巴斯特告訴人們，消滅養蠶病很簡單，通過檢查消滅病蛾，遏制蠶病蔓延，不用病蛾的卵孵化蠶。這個方法挽救了法國的養蠶業。
巴斯德壹生有許多發明創造，為生物科學和醫學做出了傑出貢獻。壹次偶然的機會，使他發現了壹塊衣雞霍的靈丹妙藥。
雞霍亂是壹種傳播迅速、來勢異常兇猛的瘟疫，雞壹旦感染雞霍亂，就會成批死亡。有時，人們看到壹些雞還在周圍覓食，過了壹會兒卻突然兩腿發抖，繼而倒地不起，掙紮幾下便壹命嗚呼。1880年，法國農村流行可怕的雞霍亂，巴斯德決心為這場瘟疫服務。
為了弄清雞霍亂的病因，巴斯德從培養純凈的雞霍亂病菌作為突破口，他嘗試了多種培養液，他得出結論：雞的腸道是最適合雞霍亂病菌繁殖的環境，傳染源就是雞的糞便。他做了很多實驗，但都失敗了。在茫然和無序中，他只得放松下來，停止研究，休息壹下。
休息了幾天後，巴斯德又開始研究實驗，這壹次，他們找到了 "新大陸"。他用以前的培養液接種雞，雞卻沒有被感染，好像雞身上的霍亂菌失去了作用。這是怎麽回事呢？巴斯德順藤摸瓜，終於發現，由於空氣中氧氣的作用，霍亂菌的毒力逐漸減弱。於是，他把幾天、1個月、2個月和3個月的菌液，分別註入健康的雞體內，做了壹組對比實驗，雞的死亡率分別為100%、80%、50%和10%。如果註射更長時間的菌液，雞雖然也會生病，但不會死亡。事情還沒有到此結束，他又用另壹種新鮮菌液給同壹批雞再次接種，令他驚奇的是，接種了舊菌液的雞幾乎都安然無恙，而沒有接種舊菌液的雞卻死得凈光。實踐證明，凡是註射過低毒菌液的雞，再給它註射足以毒死人的雞霍亂菌，它也有抵抗力，病情輕微，甚至無影響。
預防雞霍亂的方法找到了！巴斯德從這壹偶然發現中證實了減毒免疫法的原理，使他萌生了參與制造炭疽疫苗的想法。雖然在他之前，英國醫生琴納發明了牛痘接種法，但有意識地培育制造成功免疫疫苗，並廣泛應用於各種疾病的預防，巴斯德可謂第壹人。
"意誌、工作、成功，是人生的三要素。意誌將打開妳事業的大門；工作是通向房間的道路；這條道路的盡頭，有壹個成功來慶祝妳努力的結果......，只要有堅強的意誌，勤奮的工作，就壹定有成功的壹天"，這是巴斯德關於成功的壹段最重要的話。