2.盛放血細胞的容器最好是塑料的。雞血細胞釋放出破碎的DNA後,容易被玻璃容器吸附,因為細胞中DNA的含量本來就比較少,再被玻璃容器吸附到壹部分,提取到的DNA就更少了。因此,在實驗過程中最好使用塑料燒杯和試管,這樣可以減少 DNA 在提取過程中的損失。
3.獲得更純凈DNA的關鍵步驟。
(1)充分攪拌雞血細胞液DNA存在於雞血細胞核中。將雞血細胞液與蒸餾水混合後,必須用玻璃棒朝壹個方向快速攪拌,以加速雞血細胞的破裂,使 DNA 釋放出來。
(2)必須使用冷酒精沈澱DNA實驗前必須準備好大量體積分數為95%的酒精,並在冰箱中(至少5S以下)保存至少24小時。
(3)正確攪拌含懸浮液的溶液實驗的第3、5、7步需要用玻璃棒攪拌。教師應提醒學生,在步驟 3 和 5 中,玻璃棒不能直接插入燒杯底部,攪拌時動作要輕柔,以便獲得更完整的 DNA 分子。第7步,將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢轉動510分鐘。
三、參考文獻
實驗原理補充介紹
1.DNA 的釋放 DNA 位於雞血細胞的細胞核中,正常情況下是不會釋放出來的。為了使 DNA 從細胞核中釋放出來,在雞血細胞中加入蒸餾水並攪拌。蒸餾水對雞血細胞來說是壹種低滲液體,水可以大量進入血細胞,導致血細胞破裂。同時,再加上攪拌的機械作用,加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜破裂),從而釋放出 DNA,當然還有 RNA。不過,釋放出的 DNA 和 RNA 有大量與蛋白質結合的趨勢。
2.DNA與蛋白質的分離 根據二者的特點,即在較高濃度的氯化鈉溶液中(物質濃度為2 moL/L),核蛋白容易解聚,遊離出DNA。而DNA在較高濃度的氯化鈉溶液中溶解度很高,Na+與帶負電荷的DNA結合成DNA鈉鹽。此時,DNA就溶解在溶液中了。
3.DNA的沈澱和獲得利用DNA在較低濃度氯化鈉溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的較高濃度氯化鈉溶液中加入大量(300 mL)蒸餾水,稀釋氯化鈉溶液,使DNA的溶解度減小,而蛋白質的溶解度增大(這就是蛋白質的鹽溶現象),使兩者分離。此時,再加上不斷攪拌,溶解度下降的 DNA 逐漸呈絲狀。過濾掉蛋白質,就可以得到 DNA 的粘性物質。如離心法較好,以4000 r/min的轉速,離心15 min,除去上清液(含蛋白質),留下含DNA的沈澱。
4.DNA再溶解後,用較高濃度的氯化鈉溶液溶解DNA粘液。
5.DNA 的沈澱和濃縮 去除蛋白質的核酸溶液必須進壹步沈澱和濃縮。最常用的方法是酒精沈澱。即在含Na+的DNA溶液中,加入相當於兩倍體積分數的95%冷酒精溶液,混合後可使DNA沈澱、濃縮,形成含雜質較少的DNA細絲,懸浮在溶液中。如果絲狀物較少,可將混合物在冰箱中冷卻幾分鐘。可以通過緩慢旋轉玻璃棒來卷起濃縮的 DNA 細絲(因為玻璃棒會吸附 DNA)。
6.鑒定 DNA 本實驗中鑒定 DNA 的方法是二苯胺法(配方見下面的 "藥品制備")。二苯胺法的原理是:DNA中的嘌呤核苷酸在脫氧核糖酸上生成ω-羥基-γ酮戊二醛,它與二苯胺作用而呈現藍色(溶液呈淡藍色)。
溶液藍色的深淺與溶液中 DNA 的含量有關。
二苯胺試劑的制備
液體 A:將 15 g 二苯胺溶於 100 mL 冰醋酸中,然後加入 15 mL 濃硫酸,保存在棕色瓶中。如果冰乙酸已結晶,則需要加溫待其融化後再使用。
液體 B:乙醛體積分數為 0.2%。
配制:在 10 mL A 液中加入 0.1 mL B 液,即可使用。
另壹種DNA的粗提取和鑒定方法
1.材料 儀器
新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)。
塑料燒杯、量筒、玻璃棒、尼龍紗布、瓷研缽、試管、試管架、試管架、漏鬥、酒精燈、石棉網、三腳架、火柴、刀片、天平。
研磨液、體積分數為 95%的酒精溶液、二苯胺試劑、蒸餾水。
2.方法步驟
(1)DNA的粗提取
①材料準備 新鮮花椰菜和體積分數為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室至少24小時。
②材料取樣 稱取30 g花椰菜,去梗切碎。
③研磨 將切碎的黃花菜放入研缽中,倒入 10 mL 研磨液,研磨 10 min。
④過濾 在漏鬥中墊上尼龍紗布,將黃花菜研磨液過濾後倒入燒杯中(有條件的學校可將其倒入塑料離心管中進行離心,轉速為1 000r/min,離心25 min,取上清液放入燒杯中)。將上清液放入燒杯中)。將上清液放入 4 ℃冰箱中冷藏幾分鐘,然後取上清液。
⑤加入冷酒精 將兩倍體積的上清液倒入兩倍體積的 95%冷酒精溶液中,用玻璃棒輕輕攪拌溶液(玻璃棒不能直接插入燒杯底部)。沈澱 35 分鐘後,出現白色 DNA 絮狀物。慢慢轉動玻璃棒,絮狀物會纏繞在玻璃棒上。
(2)DNA 的鑒定
①二苯胺試劑的制備 取 0.1 mL B 液,滴入 10 mL A 液中,混勻。
② 鑒定 取 4 mL DNA 提取液於試管中,加入 4 mL 二苯胺試劑,混勻,觀察溶液顏色(不變為藍色)。用沸水浴(100 ℃)加熱 10 分鐘。在加熱過程中,隨時註意試管中溶液顏色的變化(逐漸呈現淡藍色)。
研磨液的配制方法
三羥甲基氨基甲烷:10.1 g(相對分子質量為 121.14),溶於 50 mL 蒸餾水中,用鹽酸調節 pH 值至 8.0,濃度為 2 moL/L,然後加入下列藥物。
NaCl:8.76 g(相對分子質量 58.44)
EDTA:37.2 g(相對分子質量 372.24)
SDS:20 g(相對分子質量 288.3)
上述藥品全部溶解後,用蒸餾水配成 1000 mL 溶液。室溫低於 20℃時,SDS 有沈澱析出,此時需升高溫度,以溶解 SDS。如果事先配制好的研磨液中有沈澱,則應升溫使沈澱溶解後再使用。
研磨液中幾種藥物的作用
SDS(十二烷基硫酸鈉):可使蛋白質變性,與 DNA 分離。
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):是DNA酶的抑制劑,可防止DNA酶在細胞破碎後降解DNA。
氯化鈉溶液的物質濃度為0.15 moL/L:能很好地溶解DNA。
Tris/HCl:提供壹個緩沖體系,DNA在其中得到穩定。Tris/HCl:提供穩定 DNA 的緩沖體系。(Tris 是三(羥甲基)氨基甲烷)
DNA 的其他鑒定方法 紫外線照射法對鑒定 DNA 非常有效。具體鑒定方法如下。
1.制備染色劑。用蒸餾水配制百萬分之五的溴化乙錠(EB)溶液。
2.在蠟紙上擦拭玻璃棒上纏繞的白色絮狀物,然後滴 1 滴 EB 溶液進行染色。
3.
3.將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下,可見橘紅色熒光(DNA 的紫外吸收峰值在 280 nm)。