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分光光度計的原理是什麽?

在分光光度計中,將不同波長的光連續照射到壹定濃度的樣品溶液上,可以得到不同波長對應的吸收強度。如果以波長(λ)為橫坐標,以吸收強度(a)為縱坐標,就可以畫出物質的吸收光譜曲線。利用這種曲線對物質進行定性和定量分析的方法稱為分光光度法,也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質的方法稱為紫外分光光度法。用可見光源測定有色物質的方法稱為可見光光度法。它們基於比爾-朗伯定律,就像比色法壹樣。

近年來,紫外可見分光光度法分析得到了廣泛的應用,不僅可用於物質的鑒定和結構分析,還可用於某些物質的測定。

光譜技術可用於:

通過測量物質的吸收或發射光譜來確定其成分。

通過測量適當波長的信號強度來確定壹種物質單獨或與其他物質混合的含量。

通過測量底物消失的量或產物出現的量與時間之間的關系,可以跟蹤反應過程。

1.紫外可見分光光度計這是壹種僅在可見光和紫外光譜應用範圍內測量物質吸收輻射的技術,應用廣泛。其中,分光光度計可用於精確測量特定波長的吸收值,而色度計是壹種相對簡單的測量儀器,其原理是利用濾光片測量更寬波段(如可見光中的綠光、紅光或藍光範圍)的吸收值。

光吸收定律:

溶液吸收光有兩個基本定律:

光穿過溶液的吸收值與吸收溶質的分子數呈指數關系(即溶質濃度[C])。

穿過溶液的光的吸收值與穿過吸收溶液的路徑長度L成指數關系。

這兩個定律包含在比爾-朗伯關系中。它們通常用入射光(Io)和出射光(I)的光密度來表示:

ε其中ε是吸收物質和波長的常數,稱為吸收系數或吸收系數,[C]的單位是mol/L或G/L,L的單位是ml。這個公式非常有用,因為大部分分光光度計都是設計用來直接測量log10(Io/I)的值(a)或消光值(e)(舊教材中可能會用這個術語來廢除:。A和c呈線性關系,吸收值通常用下標表示,如A550表示550nm處的吸收值。光通過溶液的比率稱為透光率(T),可以從出射光與入射光的比率獲得。

吸收值(a)(吸收率)-從公式中得出:

透光率(T)-通常用百分數表示:T=(I/Io)× (I)比色計比色計用於測定顏色明顯的測試對象和溶液的主要成分,如血液中的紅細胞。也可在測試對象中加入試劑,形成有色產物(發色團),如茚三酮法測定氨基酸含量。

光源通常是鎢絲燈泡,通過凸透鏡聚焦產生壹束平行光。平行光穿過充滿溶液的玻璃樣品或池,然後通過彩色濾光片到達光電管檢測器。探測器產生與落在光電管上的光密度成正比的電位,來自光電管的信號被放大,然後傳輸到檢流計或數字閱讀器。

色度計的使用:

①打開電源使儀器穩定,使用前讓燈預熱至少5min(2)選擇與基板顏色互補的濾光片;③調零(空白對照調零);④調整靈敏度;⑤分析樣品和標準溶液;⑥由於不同的比色皿具有不同的吸光特性和杯壁厚度,為了提高準確度,同壹實驗中使用同壹比色皿,並且在比色皿中的朝向相同;⑦每次樣品測量前清潔比色皿;⑧經常對同壹溶液進行重復測定,以檢驗比色計的重復性;⑨用標準溶液繪制標準曲線。

由於大多數濾光片所過濾的光的波段非常寬,所以色度計既不能用來測定壹種化合物,也不能用來區分混合溶液中兩種吸收特性非常相似的物質。色度計中使用的光電池的變異系數約為0.5%,因此不適合要求高精度的工作。用這種最簡單的儀器,由於儀器上對數測量刻度單位的隨機性,即使把儀器上的靈敏度/刻度調到零控制點,從壹臺儀器上得到的值也不能和從另壹臺儀器上測得的值直接比較,也不能在同壹臺儀器的不同設置之間直接比較。色度計不適用於特定波長的量化。

(2)紫外/可見分光光度計紫外/可見分光光度計的基本裝置采用壹盞高強度的鎢燈作為光源,可在可見光範圍內(400-700 nm)可調。氘燈用於紫外分光光度測量(200-400納米)。使用氘燈時應使用應時杯,因為紫外線無法穿透玻璃。

分光光度計之所以優於色度計,是因為它用壹個衍射光柵把光源的多色光轉換成單色平行光束。實際上,這種單色光產生的光並不是某壹波長的光,而是帶寬很窄的光,這是分光光度計的壹個重要特性,因為它決定了吸收測量所用的波長——普通分光光度計的帶寬為5~10nm。用於研究的儀器帶寬小於是因為光柵間隙的寬度影響帶寬,帶寬隨著光柵間隙寬度的減小而減小。為了獲得特定波長的準確數據,應盡可能使用最小的間隙寬度。但是,減小間隙寬度也會降低到達顯示器的亮度和信噪比。間隙寬度可以減小的程度取決於檢測/擴增系統的靈敏度和穩定性。

大多數紫外/可見分光光度計使用的比色皿的光路是65438±00n m。壹次性塑料杯適用於測量可見光範圍內的水和乙醇溶液。玻璃比色皿的生產需要更嚴格的標準,因此玻璃比色皿應在精確研究中使用,尤其是當溶液的吸收值非常低(

測量前,比色皿應清潔無劃痕,外表面應幹燥,液體應保持在適當的高度,並放在比色皿中的正確位置。生物樣品中的蛋白質和核酸可能會沈積在玻璃/應時杯的內表面,因此需要用棉球蘸丙酮擦去比色皿中的沈澱,或在1mol/L硝酸中浸泡過夜。腐蝕性和毒性溶液必須使用帶蓋的比色皿,以防溢出。

基本分光光度計中使用的光電管類似於色度計中使用的光電管。在許多情況下,當波長高於或低於550~600nm時,必須使用不同的光電池,因為它們在可見光波長內具有不同的靈敏度。更令人興奮的儀器使用比光電管靈敏度和穩定性更高的檢測器。數字顯示由於不易產生視覺誤差和誤讀量程誤差,正逐漸取代指針式讀數。有些儀器可以直接給出被測物質。

。紫外/可見分光光度計的類型:

基本的分光光度計只能產生壹束光。本儀器先用空白對照將吸收值調至零,然後取出空白液,加入待測液,測量待測液的吸收值。還有雙光束分光光度計,單色光源產生的光束分為兩束,其中壹束通過待測液體。另壹束穿過空白液體。電子電路通過比較穿過待測液體和空白液體的出射光來測量吸收值。該雙光束分光光度計減小了由於光源輸出不穩定或檢測系統靈敏度變化引起的測量誤差。此時,待測液體和對照液體同時被測量。記錄分光光度計是壹種雙光束分析儀,用於記錄已知波段內吸收值隨時間的變化(例如用於酶分析)。

分光光度計的定量分析:

如果已知某壹物質在某壹波長的吸收率(通常是該物質的最大吸收值,此時靈敏度最高),則可以通過比爾-朗伯關系計算出該物質純溶液的濃度。摩爾吸光系數是指該物質在濃度為65438±0mol/L時的吸光值,比色杯厚度為65438±0cm。這個值可以從光譜數據表中找到。也可以通過實驗測量壹系列已知濃度物質的吸收值,繪制標準曲線。這樣,在所需的濃度範圍內,就可以確定吸收值與濃度的線性關系,這條直線的斜率就是摩爾吸收系數。

比吸光度是指質量溶液濃度為65438±00g/L,比色杯厚度為65438±0cm時測得的吸光度。該值對於測定未知分子量的物質非常有用,如蛋白質核酸。在這種情況下,溶液中物質的含量用其質量而不是摩爾濃度來表示。當使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時,

這種簡單的方法不能用於測定混合樣品。在這種情況下,可以通過測量幾個波長的吸光度來估計每種成分的含量,例如,可以通過這種方法在存在核酸的情況下估計蛋白質含量。

如何使用分光光度計:

(1)接通電源;(2)使用前預熱65438±05分鐘;(3)選擇波長;(4)選擇探測器;(5)如果可能,選擇正確的縫寬;(6)插入適當的空白對照;(7)將透光率調節至0%;(8)將吸收值調整到零;(9)分析樣品;(10)測量10個樣品後,用空白對照檢查零刻度;(11)測試儀器的重復性。

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