細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。
菌種
試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍幹燥菌種為第0代），並采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ]
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC ( F ) 98001〕
黑曲黴（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]
菌液制備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24～48小時。上述培養物用0 . 9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5～7天，加人3～5ml含0.05 % ( ml /ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05 % ( ml / ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。
菌液制備後若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2～8 ℃，可在24小時內使用。黑曲黴孢子懸液可保存在2～8 ℃，在驗證過的貯存期內使用。
適用性檢查
取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50～100cfu，分別註入無菌平皿中，立即傾註營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃培養48小時，計數；取白色念珠菌、黑曲黴各50～100cfu，分別註入無菌平皿中，立即傾註玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數；取白色念珠菌50～100cfu，註入無菌平皿中，立即傾註酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基．平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。
結果判定
若被檢培養基上的菌落平均數不小於對照培養基上的菌落平均數的70 %，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落壹致，判該培養基的適用性檢查符合規定。 當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。
驗證時，按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐壹進行驗證。
菌種及菌液制備
同計數培養鑒的適用性檢查。
驗證方法
驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
( l )試驗組平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml和50～100cfu試驗菌，分別註人平皿中，立即傾註瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後壹次的沖洗液中加人50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。
( 2 )菌液組測定所加的試驗菌數。
( 3 )供試品對照組取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
( 4 )稀釋劑對照組若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每lml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。
結果判斷
在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70 %。若試驗組的菌數回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任壹次試驗中試驗組的菌數回收率低於70 %，應采用培養基稀釋法、離心沈澱法、薄膜過濾法、中和法（常見幹擾物的中和劑或滅活方法見表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。
表l 常見幹擾物的中和劑或滅活方法 幹擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫鈉 酚類、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑 亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰類 聚山梨酯 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA ) 鎂或鈣離子 磺胺類 對氨基苯甲酸 β-內酰胺類抗生素 β-內酰胺酶 若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那麽驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌汙染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。
計數方法驗證時，采用上述方法若還存在壹株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麽選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。
驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。