雙向凝膠電泳和質譜法是目前最廣泛使用的蛋白質組學研究方法。雙向凝膠電泳利用蛋白質等電點和分子量的差異來區分各種蛋白質。雖然二維凝膠電泳難以識別低豐度蛋白質，對操作要求較高，但其通量大、分辨率高、重現性好，且可與質譜聯用，是目前最流行、最可靠的蛋白質組學研究手段。基於雙向凝膠電泳技術和質譜技術的蛋白質組學研究流程為樣品制備→等電聚焦→聚丙烯酰胺凝膠電泳→凝膠染色→挖掘出感興趣的蛋白質點→凝膠內消化→質譜分析確定肽指紋或部分氨基酸序列→利用數據庫鑒定蛋白質。蛋白質組研究需要高分辨率的蛋白質分離和準確、靈敏的質譜鑒定技術。凝膠電泳中蛋白質的著色不僅會影響蛋白質分離的分辨率，還會影響後續的質譜鑒定。蛋白質染色可分為有機試劑染色、銀染色、熒光染色和同位素著色四種。
Unlu等人提出了熒光差示雙向電泳（F-2D-DIGE）的蛋白質組學定量分析方法。差示凝膠電泳（DIGE）是對2-DE的技術改進，它結合了多重熒光分析的方法，在同壹凝膠****上分離多個不同熒光標記的樣品，並首次引入了內標物的概念。將兩個樣品中的蛋白質用不同的熒光標記混合後進行 2-DE，用來檢測兩個樣品中蛋白質的表達，大大提高了檢測結果的準確性、可靠性和可重復性。在 DIGE 技術中，每個蛋白點都有自己的內標，軟件可根據內標全自動校準每個蛋白點的表達量，確保檢測到的蛋白豐度變化是真實的。
高效液相色譜（HPLC）
雖然二維凝膠電泳（2-DE）是分析整個蛋白質組的常用方法，但它存在分離能力有限、鑒別效果差、操作步驟復雜等缺點。Chong等人利用高效液相色譜/質譜法比較分析了惡性腫瘤前期和癌癥兩種蛋白質的差異表達。用高效液相色譜分離蛋白質，然後用 MALDI-TOF-MS 對收集到的餾分進行鑒定，從而對兩種細胞中差異表達的蛋白質進行定量分析。多維液相色譜作為壹種新型分離技術，沒有相對分子質量和等電點的限制，通過不同模式的組合消除了二維凝膠電泳的鑒別作用，具有峰容量大、易於自動化的特點。二維離子交換-反相色譜（2D-IEC-RPLC）是蛋白質組學研究中最常用的多維液相色譜分離系統。
飛行時間質譜
表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（SELDI）由諾貝爾化學獎獲得者田中於2002年發明，目前在學術界引起了極大的關註。SELDI是蛋白質組學研究的理想平臺，被稱為表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（SELDI-tof）。SELDI-tof）。其方法主要是：通常將樣品經過簡單預處理後直接滴加到表面經過特殊修飾的芯片上，這樣既可以比較兩個樣品之間的差異蛋白，也可以獲得樣品的總蛋白概況。SELDI 可用於分析復雜的生物樣本，因為樣本無需通過液相色譜或氣相色譜進行預純化。SELDI 可以分析疏水性蛋白質、高或低 PI 蛋白質以及低分子質量（< 25,000）蛋白質，它還可以檢測出許多隱藏在未處理樣品中的低濃度蛋白質，增加了檢測出未處理樣品中被掩蓋的蛋白質的機會。SELDI 只需少量樣品，可在短時間內得到結果，且重現性好，適合臨床診斷和大規模篩查疾病相關的生物標記物，特別是可直接檢測未經處理的尿液、血液、腦脊液、關節腔滑液、支氣管沖洗液、細胞裂解液和分泌物，因此可檢測高或低 PI、低分子質量（<；25,000）的樣本中檢測生物標記物，它還能檢測未處理樣本中許多隱藏的蛋白質，從而增加發現生物標記物的機會。此外，它還能檢測樣本中目標蛋白的分子量、PI、糖基化位點、磷酸化位點等參數。
同位素標記親和標記（ICAT）
同位素標記親和標記（ICAT）是壹種用於蛋白質分離和分析的技術，是蛋白質組學研究的核心技術之壹。該技術使用不同質量的同位素親和標記（ICAT）來標記不同狀態細胞中的半胱氨酸，然後使用串聯質譜法對混合樣品進行分析。來自兩個樣本的同壹類蛋白質會形成兩個不同的峰形，可以很容易地識別和比較，從而非常準確地比較兩個樣本的蛋白質表達水平。ICAT 的好處是可以直接檢測混合樣本；能夠快速鑒定和量化低豐度蛋白質，特別是膜蛋白等疏水性蛋白質；能夠快速鑒定重要的功能性蛋白質。
使用新型 ICAT 試劑，結合液相色譜法和串聯質譜法，不僅大大彌補了雙向電泳的不足，而且使高通量、自動化的蛋白質組分析變得更簡單、更準確、更快捷，代表了蛋白質組分析技術的主要發展方向。對於磷酸化蛋白的分析，與固相技術相結合的 ICAT 技術本身已經取得了很多有意義的進展，目前已經形成了 ICA T 系列技術。
生物信息學技術
生物信息學在生命科學研究中發揮著越來越重要的作用。利用生物信息學處理和分析蛋白質組的各種數據也是蛋白質組研究的重要組成部分。生物信息學是蛋白質組學研究不可或缺的壹部分。生物信息學的發展不僅能單純分析基因組和蛋白質組數據，還能全面分析已知或新的基因產物。生物體、組織或細胞表達的全部蛋白質信息都儲存在蛋白質組數據庫中，只要用鼠標點擊雙向凝膠電泳圖譜上的蛋白質點，就能獲得這些信息
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