病原微生物學免疫診斷技術綜述

摘要：病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢測技術也在不斷發展和進步。目前，應用較為廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接塗片鏡檢、分離培養、生化反應、血清學反應、核酸分子雜交、基因芯片、聚合酶鏈反應等。本文對這些檢測技術的進展進行了綜述。對人畜致病的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，包括病毒、細菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊病毒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、癡呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之壹。近年來出現的非典、高致病性禽流感、西尼羅河病毒感染等疾病都具有很強的傳染性，往往會造成世界範圍內的大流行，因此對病原體的檢測必須快速準確。傳統的病原體檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，對操作人員的技術要求高。隨著醫學微生物學研究技術的不斷發展，病原體診斷已不再局限於病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測方法不斷出現並被應用到臨床和實驗室J。核酸分子雜交技術、PCR技術、基因芯片技術等檢測方法，自動化程度高，快速省時，無汙染，結果準確，可準確靈敏地鑒定病原微生物1。傳統的病原微生物檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，對操作人員的技術水平要求高。1 傳統的病原微生物檢測方法傳統的病原微生物實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，將標本直接塗片染色鏡檢並接種於培養基中進行分離培養是細菌或真菌感染性疾病病原學診斷常用的方法。.1 直接塗片鏡檢病原微生物體形和體積微小，大多無色半透明，染色後可借助顯微鏡觀察。染色後可借助顯微鏡觀察大小、形狀、排列。直接塗片染色顯微鏡檢查簡單快捷，目前仍適用於那些形態特殊的病原微生物感染，如淋球菌感染、結核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。1.2 分離培養和生化反應分離培養主要用於臨床標本（如血液、痰液、糞便等）或培養物中細菌種類較多時分離出某壹種細菌。細菌的生長和繁殖需要壹定的時間，檢測周期長，而且不能同時處理批量樣本。為解決這壹問題，各種自動化培養和鑒定系統應運而生，傳統的鑒定方法也逐步得到改進，大大加快了檢測速度。例如，Microscan WalLCAway 全自動微生物分析儀可以同時進行細菌鑒定和藥物敏感性測試，可檢測 500 多種細菌。苛氧菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養要求較高，常規培養陽性率較低。雍剛等通過在巧克力培養基中添加特殊的抑菌劑，如葡萄糖、玉米澱粉、生長因子、酵母粉和不等比例的氨基酸等，制成新型淋病奈瑟菌培養基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離率和培養率。蘇聖通等在營養瓊脂中添加中藥大棗、赤小豆培養鏈球菌a、鏈球菌b、肺炎鏈球菌等細菌，其生長指標明顯高於血平板。 1.3 組織細胞培養活組織細胞培養適用於專門培養存活在活組織細胞內的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細胞不盡相同，從病原體敏感的動物組織中取出活細胞在體外進行原代培養或病原體敏感的細胞系進行傳代培養，然後將病原體接種在相應的組織細胞中，病原體即可在其中繁殖生長並引起特異性細胞病理效應。也可以將病原體直接接種到敏感動物體內，引起相應組織器官的特異性病理變化。2 血清學和免疫學檢測血清學檢測是通過已知的抗體或抗原檢測病原體的抗原或抗體，簡化鑒定步驟，從而快速鑒定病原體的技術，常用的方法包括血清凝集法、乳膠凝集法、熒光抗體檢測法、協同凝集法和酶免疫測定法。常用的方法包括血清凝集技術、乳膠凝集試驗、熒光抗體檢測技術、協同凝集試驗、酶聯免疫測定技術等。酶聯免疫測定技術的應用大大提高了血清學檢測的靈敏度和特異性，它不僅能檢測樣本中的病原體抗原，還能檢測機體的抗體成分。幽門螺桿菌在我國人群中的感染率高達 50%～80%，應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測唾液中的抗 HP 抗體來診斷 HP 感染，結果令人滿意。我國人群乙型肝炎病毒（HBV）感染率很高，應用 ELISA 對乙型肝炎患者進行早期血清學診斷效果最為明顯。臨床上，致病菌往往與非致病菌混雜在壹起，如何從這些細菌中分離出目標菌是關鍵。免疫磁珠分離（IMBS）是近年來在微生物檢測領域發展起來的壹項新技術。其基本原理是將特定病原體的單抗體或多抗體或二抗體與磁珠微球耦合，通過抗原抗體反應形成磁珠-靶標-病原體復合物或磁珠-抗體-靶標-病原體復合物，然後在外加磁場的磁力作用下將靶標病原體分離出來。目前已開發出針對大腸桿菌、李斯特菌、白色念珠菌、軍團菌等多種病原體的免疫磁珠，廣泛應用於各級科研和實驗室。用 IMBS 分離的白色念珠菌可直接在顯微鏡下檢測，檢測時間可縮短至 4 小時。IM-Bs 還可與其他檢測技術結合使用，檢測病原體，免疫磁珠分離出的目標細菌可用於分離和培養，從而使大腸桿菌 0157 的最低檢測限從 200 cfu-g 提高到 2 cfu-g～；IMBS 結合聚合酶鏈反應（IMBS-PCR）可用於苛氧菌、厭氧菌等特殊培養條件細菌的快速檢測，IMBS-PCR 對肉類產毒梭狀芽孢桿菌的檢測時間縮短至 10 h，最低檢測限可達 10 cfu-g～，IMBS 結合實時熒光定量 PCR（IMBS-PCR）用於苛氧菌、厭氧菌等特殊培養條件細菌的快速檢測。熒光定量 PCR（IMBS-RT-PCR）成功檢測了水中的輪狀病毒和草莓中的諾如病毒，檢測時間大大縮短；Leon-Velarde 等采用 IMBS8 結合酶聯檢測，大大提高了沙門氏菌的檢測效率。3 基因檢測隨著科技水平的發展，分子生物學檢測技術日新月異，對病原微生物的鑒定不再局限於普通的外部形態結構和生理生化特征的壹般檢測，而是深入到分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列，即基因片段具有特異性，不同於其他種或屬，檢測其獨特的基因片段序列可以用來鑒定病原微生物。3.1 核酸雜交技術具有壹定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中根據堿基互補配對的原理變成異質雙鏈的過程稱為核酸雜交，而雜交的雙方就是使用的探針和被檢測的核酸。在病原微生物的檢測中，核酸分子雜交主要包括膜印跡雜交和核酸原位雜交。膜印雜交是指從微生物細胞中分離核酸，純化後與壹定的固相支持物體外結合，並與存在於液相中的標記核酸探針雜交。核酸原位雜交是將標記的核酸探針直接與細胞或組織切片中的核酸雜交。探針還可以進行熒光標記，以便在熒光顯微鏡或激光掃描****聚焦顯微鏡下識別病原體，並顯示病原體在三維空間中的位置。與其他方法相比，核酸分子雜交檢測的顯著優點是簡單、靈敏、快速和特異。Wong 等人使用熒光標記的兩種不同寡核苷酸探針檢測血液標本中的假單胞菌和鐮刀菌，最低檢測限為 10 cfu-mL，特異性為 100%，檢測時間小於 2 小時。寡核苷酸探針是針對病原體特異性基因序列設計的，可將待檢測的病原體定位在不同的分類類別中，如科、屬、種和亞種"。(病原微生物檢測技術進展） 3.2 基因芯片技術基因芯片（DNA chip），又稱 DNA 微陣列（DNA microarray）或 DNA 芯片，是生物芯片 j 的壹種，是核酸分子雜交技術發展的延伸。通過微處理技術，將數以萬計甚至數以百萬計的基因探針，即DNA片段，有規律地排列成二維DNA探針陣列，固定在矽芯片、載玻片等固體支持物上，與標記的樣品分子雜交，進行核酸雜交，用於基因檢測。其測序原理與核酸雜交相同，但解決了傳統核酸雜交技術操作繁瑣、檢測效率低、自動化程度低的缺點。基因芯片在病原微生物感染診斷中的應用，大大縮短了診斷時間，可以檢測病原體是否耐藥、對那些抗生素耐藥、對那些抗生素敏感。Naas 等人設計了壹種基因芯片，可以檢測銅綠假單胞菌、腸桿菌科、鮑氏菌科中各種類型的 B 內酰胺酶耐藥基因。Ting Cai 等人設計的基因芯片檢測了大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和泄殖腔腸桿菌對 l7 種抗菌藥物的耐藥率。Batchelor 等人開發的基因芯片檢測到大腸桿菌和沙門氏菌對超廣譜 8.5 內酰胺酶、磺胺類藥物、四環素類藥物、氨基糖苷類藥物等的 47 個耐藥基因。基因芯片技術也存在壹些亟待解決的問題，如提高芯片的特異性和檢測信號的靈敏度、降低芯片的生產成本等，而且大多數芯片都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因芯片到目前還主要局限於實驗室研究而不能廣泛應用於臨床病原微生物的檢測和鑒定。(病原微生物檢測技術） 3.3 PCR 技術聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是壹種在體外用已知的寡核苷酸引物引導未知片段中的基因片段進行微量檢測和擴增的技術。由於 PCR 可以擴增待測基因，因此特別適用於病原體感染的早期診斷，但如果引物的特異性不強，可能會造成假陽性。近二十年來，PCR 技術發展迅速，從基因擴增到基因的克隆和修飾以及基因分析，可靠性逐漸提高。Jbara 使用 PCR 和傳統方法直接檢測了 75 份樣本中的流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌。Jbara 使用 PCR 和傳統方法直接檢測了 75 份樣本中的流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌和肺炎鏈球菌，與傳統方法相比，PCR 的特異性和靈敏度分別為 87.3%和 100%。1988 年，Chamberian 等人提出了多重 PCR 的概念，即在同壹 PCR 反應體系中加入兩對以上的引物，可同時擴增多個核酸片段，適用於大量樣本的分析鑒定。多重 PCR 具有(1）效率高，在同壹反應體系中可同時檢測多種病原微生物，或對同壹病原微生物進行不同類型的分型；（2）系統性強，多重 PCR 非常適合檢測壹組病原體，如同時檢測幾種類型的肝炎病毒；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多種性傳播疾病病原體感染；需要進行特殊培養的厭氧菌感染、破傷風、厭氧菌感染；需要進行特殊培養的無芽胞厭氧菌感染；B.破傷風桿菌、炭疽桿菌、綠膿桿菌、鼠疫耶爾森菌等戰傷感染；（3）經濟簡便，在同壹反應管中同時檢測多種病原體，節省試劑、成本和時間，為臨床提供更快、更準確的診斷信息。從 90 份發熱但培養陰性的腦膜炎患兒腦脊液樣本中檢測出腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌，特異性為 100%，靈敏度為 89%。實時熒光定量 PCR 是在 PCR 反應系統中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個 PCR 過程。它具有高靈敏度、高特異性、有效解決 PCR 汙染和高度自動化的特點。實時熒光定量 PCR 在性病病原體的早期診斷、窗口期篩查、療效檢測、基因變異分析和預後評估等方面具有重要價值，並為流行病學調查提供幫助 J. Wang Ping 等建立了多重實時熒光定量 PCR 反應系統，該系統能同時快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和產腸毒素 A 金黃色葡萄球菌。用熒光基團標記的特異性引物能準確反映病原體感染情況和藥物療效，特別適用於病毒、衣原體等不可培養和難以培養的病原體感染的診斷。基因芯片技術與多重 PCR 技術相結合，既能通過 PCR 擴增目的基因，又能提高基因芯片熒光探針檢測的靈敏度和特異性，使兩種檢測技術優勢互補，已廣泛應用於病原微生物的檢測。以病原菌特異性基因為靶基因設計引物和探針，進行多重 PCR 擴增，制備寡核苷酸芯片，然後對待測樣品的靶基因進行多重 PCR 擴增，將擴增產物與多重 PCR 基因芯片檢測系統中的病原菌進行雜交，可根據雜交信號直觀地讀取樣品中所含病原菌的種類、類型、毒力、侵襲力，從而進行病原菌的檢測和鑒定。病原體的檢測和鑒定。(病原微生物檢測技術） 3.4 其他基因檢測技術分子生物學技術發展迅速，各種新的基因檢測方法不斷出現。Notomi 等於 2000 年開發出壹種新的環介導等溫擴增核酸（1oop-mediated isothermal amplifi- cation of DNA，簡稱 L Notomi 等。該方法針對目標基因序列上的 6 或 8 個特定區域設計 4 或 6 個引物，然後在具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶作用下形成環狀結構並進行鏈置換，從而擴增大量目標 DNA。短短幾年間，LAMP 已廣泛應用於疾病診斷、食品檢測、環境監測、生物安全等多個方面心 ]。李萌等用 LAMP 檢測 16 個開放性傷口感染分泌物中的破傷風梭菌 60 分鐘，其中 4 個呈陽性，最低檢測限為 4 x 10。壹項研究報告l2 指出，用 LAMP 技術對 200 名結核病患者的痰標本進行快速檢測，結核分枝桿菌的陽性檢出率遠高於培養和染色法。多病竈變異念珠串聯重復分析法（MLVA）是壹種根據病原體基因組中變異念珠串聯重復序列的特征來分析病原體基因組的方法。MLVA 是根據病原體基因組中可變數目的串聯重復序列對病原體進行基因分型的技術，廣泛應用於金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、炭疽桿菌等病原體的基因分型和鑒定。4 總結與展望快速準確地檢測和鑒定病原體是預防和控制傳染病的首要問題。隨著生物學研究從宏觀領域向微觀領域的發展，病原體檢測方法也從組織形態水平向分子水平和基因水平滲透。近年來發展起來的高通量檢測病原微生物所需樣本少、快速省時、無汙染、診斷結果準確、自動化程度高等特點，相信隨著研究的不斷進步和深入，這些高通量診斷技術和方法將在病原微生物的診斷和分析中發揮越來越重要的作用，而多種檢測技術的組合與合成更是具有廣闊的應用前景。