讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那麽50 mM葡萄糖是幹什麽的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖後最大的好處只是懸浮後的大腸桿菌不會快速沈積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那麽EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什麽大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間裏完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天妳手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴妳，只要用等體積的水，或LB培養基來懸浮菌體就可以了。有壹點不能忘的是，菌體壹定要懸浮均勻，不能有結塊。
輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合後使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4 N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由於細胞膜發生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試壹下），自然就難高效率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沈澱，這是由於沒有正確理解壹些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什麽要加SDS呢？那是為下壹步操作做的鋪墊。這壹步要記住兩點：第壹，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子壹樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，後面我再詳細說明。
每個人都知道，溶液III加入後就會有大量的沈澱，但大部分人卻不明白這沈澱的本質。最容易產生的誤解是，當 SDS碰到酸性後發生的沈澱。如果妳這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2 M的醋酸溶液看看就知道不是這麽回事了。大量沈澱的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沈澱，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沈澱出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沈澱，那會不會是遇鹽發生的沈澱呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的 NaCl，妳會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沈澱的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沈澱。但如果妳加入的不是NaCl而是 KCl，妳會發現沈澱的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沈澱。如此看來，溶液III加入後的沈澱實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沈澱更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合壹個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沈澱自然就將絕大部分蛋白質沈澱了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也壹起被***沈澱了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給***沈澱了，盡管SDS並不與DNA分子結合。那麽2 M的醋酸又是為什麽而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA壹旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS***沈澱了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到壹條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入後基因組DNA無法快速復性就被沈澱了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產物，與它是不是沈澱下來其實沒有關系。溶液III加入並混合均勻後在冰上放置，目的是為了PDS沈澱更充分壹點。
不要以為PDS沈澱的形成就能將所有的蛋白質沈澱了，其實還有很多蛋白質不能被沈澱，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然後進行酒精沈澱才能得到質量穩定的質粒DNA，不然時間壹長就會因為混入的DNase而發生降解。用 25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這裏做個全面的介紹。酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大於氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心後酚相會跑到上層，不利於含質粒的水相的回收；但加入氯仿後可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有壹點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提後會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），應此如果單獨用酚抽提後壹定要用氯仿抽提壹次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沈澱時就會被除幹凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至於異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心後上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收後的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘後離心就可以將質粒DNA沈澱出來。這時候如果放到－20℃，時間壹長反而會導致大量鹽的沈澱，這點不同於普通的DNA酒精沈澱回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發生沈澱。如果感覺發生了鹽的沈澱，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置壹個小時以上，並用tip將沈澱打碎，就能得到好的樣品。
得到的質粒樣品壹般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會幹擾電泳結果的。瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數情況下妳能看到三條帶，但千萬不要認為妳看到的是超螺旋、線性和開環這三條帶。堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，不信的話妳用EcoRI來線性化質粒後再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不壹樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了壹起）。如果妳不小心在溶液II加入後過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100 kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。