高效液相色譜法的原理 分析高效液相色譜法的用途和原理
高效液相色譜法（HPLC）是分離、分析和純化有機化合物（包括通過化學反應可轉化為有機化合物的無機物）最有效、應用最廣泛的方法之壹。
在已知的有機化合物中，約有80%可以用高效液相色譜法進行分離分析，而且由於這種方法條件溫和，不破壞樣品，因此特別適用於沸點高、難氣化揮發、熱穩定性差的有機化合物和生命物質。高效液相色譜系統壹般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄和處理裝置組成。
其中，輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部分。有些儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器，以及色譜柱或保護罩、色譜柱溫度控制器等，現代高效液相色譜儀有微電腦控制系統，可實現儀器的自動化控制和數據處理。
制備型高效液相色譜儀還配有自動餾分收集裝置。目前，國外常見的高效液相色譜儀生產廠家有Waters、Agilent（原HP）、島津等，國內的上海五豐科學儀器有限公司生產的高效液相色譜儀主要有以下幾種。
壹、輸液泵 1．泵的結構和性能 輸液泵是高效液相色譜儀系統中最重要的部件之壹。輸液泵的性能直接影響分析結果的質量和可靠性。
輸液泵應具備以下性能：①流量穩定，其RSD應小於0.5%，這關系到定性定量的準確性；②流量範圍寬，分析型應在0.1～10ml/min連續調節，制備型應能達到100ml/min；③輸出壓力高，壹般應能達到150～300KG/CM2：④液缸體積小；⑤密封性能好，經久耐用，且液缸體積小。密封性能好，耐腐蝕。泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。
恒流泵按其結構又可分為螺旋註射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱塞陰影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰，目前應用最廣泛的是柱塞往復泵。
柱塞往復泵泵缸體積小，可達0.1ml，便於清洗和更換流動相，特別適用於循環和梯度洗脫；改變電機轉速即可方便地調節流量，流量不受色譜柱壓力的影響；泵送壓力可達400KG/CM2。ADW 的主要缺點是輸出的脈沖較大，現在多彩雙泵系統克服了這壹缺點。
雙泵按連接方式可分為並聯和串聯，壹般來說，並聯泵流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2～0.3%），但出現故障的幾率較多（由於單向閥較多），價格也較貴。二、進樣器 壹般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最為常見），其關鍵部件由圓形密封墊圈（轉子）和固定底座（定子）組成。
耐高壓（35~40MPA），進樣準確，重復性好（0.5%），操作簡便。六通閥進樣方式有兩種：部分加液方式和完全加液方式。
①部分加液法，進樣量不超過定量環體積的 50%（最多不超過 75%），且要求每次進樣量準確壹致。這種進樣方法的準確性和重復性是由進樣器進樣熟練程度決定的，且易產生進樣引起的峰展寬。
②完全充液進樣法，進樣體積應不少於定量環體積的5～10倍，9至少3倍，這樣才能完全置換定量環和流動相，消除壁效應，保證進樣的準確性和重復性。三、色譜柱色譜是分離分析的手段，分離是核心，所以承擔分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。
色譜柱的要求是柱效高、選擇性好、分析速度快。市售的用於高效液相色譜的各種顆粒填料有多孔性良好的矽膠和以矽膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機高分子微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒徑壹般為3、5、7、10UM等，柱效理論值可達5～16萬/m。
對於壹般的分析，只需要 5000 塊板即可；對於同系物分析，只要 500 塊即可；對於較難分離的物料對可使用高達 2 萬根柱子，因此壹般長度約為 10~30CM 的柱子即可滿足復雜混合物分析的需要。色譜柱的效率受柱內外因素的影響較大，為了使色譜柱達到最佳效率，除了柱外死體積要小以外，還要有合理的柱結構（盡量減小填料床外的死體積）和裝填技術。
即使有再好的裝填技術，柱子中心和沿壁的充填情況總是不壹樣的，靠近壁的部分比較疏松，容易產生槽流，流速較快，影響了沖洗劑的流型，拓寬了譜帶，這就是管壁效應。這種管壁面積從管壁向內約為材料直徑厚度的 30 倍。
壹般來說，在液相色譜系統中，柱效對柱效的影響要遠遠大於管壁效應。四、檢測器 高效液相色譜檢測器分為通用檢測器和專用檢測器兩大類。
1.通用檢測器可以連續測量色譜柱流出物的所有特性變化，通常采用差分測量法，這類檢測器包括示波折光檢測器、介電常數檢測器、電導檢測器等、通用型檢測器應用範圍較廣，但由於對流動相反應靈敏，因此易受溫度變化、流動相變化和組分變化的影響，噪聲和漂移較大，靈敏度較低，不能與專用檢測器配合使用，靈敏度越靈敏度較低，不能用梯度洗脫。2.專用檢測器可測量樣品分離組分的某種特性變化。
這類檢測器對流動相中不存在或至少在操作條件下不存在的樣品組分的某種物理或化學性質敏感。這類檢測器包括紫外檢測器、熒光檢測器、放射性檢測器等。
高效液相色譜如何工作？
高效液相色譜儀的工作原理：高壓泵將流動相從儲液器通過進樣器送入色譜柱，然後從檢測器的出口流出，此時整個系統充滿了流動相。當待分離的樣品從進樣器進入流動相流經進樣器時將被帶入色譜柱進行分離，分離出的不同組分依次進入檢測器，記錄器將進入檢測器的信號記錄下來，得到液相色譜圖。
高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用氣相色譜的理論，在技術上將流動相改為高壓輸送，色譜柱是用特殊的方法填充小尺寸的填料，使色譜柱的效率大大高於經典液相色譜法（每米的板數可以達到幾萬或幾十萬），同時色譜柱連接後的檢測器靈敏度高，可以用來對流出物進行連續檢測。色譜柱與高靈敏度檢測器相連，可對流出物進行連續檢測。
擴展信息
高效液相色譜儀配備有高壓二元泵或低壓四元泵，泵的沖程容積以及混合器容積的大小會對色譜圖的基線噪聲水平產生影響，尤其是在梯度洗脫的情況下。
在二元泵的應用中，需要註意的是，當二元混合物中壹種流動相的比例小於 5%時，特別是在使用正同位素洗脫法對某些藥物中間體和最終產品進行手性拆分時，更容易產生基線噪聲。在對某些藥物中間體和最終產品進行手性拆分時，最好使用單泵預混合。避免由於泵中的低比例泵液精度相對較差，而導致色譜基線沖程相關峰，
參考資料來源：搜狗百科--高效液相色譜法；搜狗百科 - 高效液相色譜儀
高效液相色譜儀基本工作原理
高效液相色譜儀基本工作原理
高效液相色譜儀系統由儲液罐、泵、進樣器組成。儲液罐中的流動相由高壓泵泵入系統，樣品溶液通過進樣器進入流動相，被流動相裝入色譜柱（固定相）。由於樣品溶液中的各組分在兩相中的分配系數不同，當它們在兩相中相對運動時，經過反復的吸附-解吸分配過程，各組分的運動速度相差較大，被分離成單個組分，以便從色譜柱中流出，當它們通過檢測器時，從色譜柱中流出。通過檢測器時，樣品的濃度會被轉換成電信號並傳輸到記錄器，數據會以圖表的形式打印出來。
高效液相色譜儀的原理是什麽
原理：儲液器中的流動相由高壓泵泵入系統，樣品溶液通過進樣器進入流動相，並被流動相裝入色譜柱（固定相）。由於樣品溶液中的成分在兩相中的分配系數不同，因此這些成分被分離成單個成分，以便移出色譜柱。在兩相的相對移動過程中，經過反復的吸附-解吸分配過程，每種組分的移動速度都會產生較大的差異。
分離出來的單個組分依次流出色譜柱，通過檢測器，樣品濃度被轉換成電信號傳輸到記錄器，數據可以以圖表的形式打印出來，以便研究人員進行分析。
擴展資料：
高效液相色譜法（HPLC），又稱 "高壓液相色譜法"、"高速液相色譜法"、"高分離液相色譜法"、"現代柱色譜法 "等。
①高壓：流動相是液體，流經色譜柱時，阻力較大，為了能快速通過色譜柱，載液必須是高壓。② 高速：分析速度快，載液流速快，比經典液相色譜快得多，通常分析壹個樣品只需 15～30 分鐘，有些樣品甚至 5 分鐘就能完成，壹般不超過 1 小時。
③ 高效：分離效率高。可選擇固定相和流動相，達到最佳分離效果，比工業蒸餾塔和氣相色譜儀的分離效率高很多倍。
④靈敏度高：紫外檢測器靈敏度可達 0.01ng，進樣量為μL。
⑤應用範圍廣：70% 以上的有機化合物都可以用高效液相色譜分析，特別是對沸點高、分子大、極性強、熱穩定性差的化合物的分離分析，顯示出優勢。
⑥色譜柱可重復使用：壹根色譜柱可用於分離不同的化合物 ⑦樣品體積小，易於回收：上柱後樣品不被破壞，可收集單壹組分或做制備。此外，高效液相色譜柱可反復使用，樣品不被破壞，易於回收等優點，但也有不足之處，與氣相色譜相比，各有所長，相輔相成。
高效液相色譜的缺點是存在 "柱外效應"。在進樣和檢測器之間，除了色譜柱外的任何死角（進樣器、色譜柱接頭、連接管和檢測池等）外，如果流動相的流動模式發生變化，任何被分離物質的擴散和滯留都會明顯導致色譜峰的展寬和色譜柱效率的降低。
高效液相色譜檢測器的靈敏度不如氣相色譜法。高效液相色譜所用的色譜柱非常細（1~6 毫米），所用固定相的粒徑也非常小（幾微米到幾十微米），因此流動相在色譜柱中的流動阻力很大，常壓下流動相的流速很慢，這使得色譜柱的效率很低，耗時很長。
為了實現快速高效的分離，有必要對流動相施加高壓，以加快流動相在色譜柱中的流速。為此，需要使用高壓泵進行高壓註入。
高壓、高速是高效液相色譜的特點之壹。高效液相色譜中使用的高壓泵應滿足以下條件：a.流速恒定，無脈動，且調節範圍大（壹般為1～10 mL/min）；b.耐溶劑腐蝕；c.有較高的輸液壓力；對於壹般分離，壓力為60*10^5 Pa即可滿足高效分離的要求，需要150～300*10^3 Pa。要達到 150~300*10^5Pa.
1）往復式柱塞泵 當柱塞被推入缸體時，泵頭出口處的單向閥（上部）打開，與此同時，流動相入口處的單向閥（下部）關閉，此時會有少量流體輸出。反之，當柱塞向外拉時，流動相入口單向閥打開，同時出口單向閥關閉，壹定量的流動相被儲液器吸入缸體。
這種泵的特點是能持續提供壹定量的流動相，而不受色譜系統其他部分阻力微小變化的影響。(2）氣動放大泵 其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積（SA）活塞 A，然後在小面積（SB）活塞 B 輸出壓力增至 p2 的液體。
參考資料：
高效液相色譜儀如何工作？
高效液相色譜儀是在經典色譜的基礎上，引用氣相色譜的理論，在技術上將流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9?107Pa）；色譜柱采用特殊方法填料，粒徑小，柱效遠高於經典液相色譜（每米板數可達幾萬或幾十萬）；同時，色譜柱背面接有高靈敏度檢測器，可連續檢測流出液。
特點 1.高壓：液相色譜以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱時，阻力較大，為了快速通過色譜柱，必須對載液施加高壓。為了快速通過色譜柱，必須對載液施加高壓，壹般為 150~350*105Pa 。
2.高速：流動相在色譜柱中的流速比經典色譜快得多，壹般可達 1~10 ml/min。
3.高效：最近研究出多種新型固定相，使分離效率大大提高。
4.4.4. 靈敏度高：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度檢測器，進壹步提高了分析的靈敏度。
如熒光檢測器的靈敏度可達 10-11g。此外，樣品量少，壹般為幾微升。
5.適應範圍廣：氣相色譜與高效液相色譜比較：氣相色譜具有分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作簡便等優點，但受技術條件的限制，沸點過高的物質或熱穩定性較差的物質很難應用氣相色譜進行分析。而高效液相色譜法，只需要將樣品制成溶液即可，無需氣化，因此不受樣品揮發性的限制。
對於沸點高、熱穩定性差、相對分子量大（大於400以上）的有機物（這類物質幾乎占有機物總量的75%～80%）原則上都可以應用高效液相色譜法進行分離、分析。據統計，在已知化合物中，可通過氣相色譜分析的約占 20%，而可通過液相色譜分析的約占 70～80%。
高效液相色譜法按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜法、疏水高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、高效離子交換液相色譜法、高效親和液相色譜法以及高效聚焦液相色譜法等類型。不同類型的高效液相色譜法分離或分析各種化合物的原理與相應的普通液相色譜法基本相似。
所不同的是，高效液相色譜具有靈敏、快速、分辨率高、重現性好的特點，而且必須在色譜儀中進行。高效液相色譜的主要類型及其分離原理 根據分離機理的不同，高效液相色譜可分為以下幾種主要類型：1.液-液分層色譜法（Liquid-liquid Partition Chromatography）和化學鍵合相色譜法（Chemically Bonded Phase Chromatography） 流動相和固定相均為液體。
流動相和固定相應互不相溶（極性不同，以避免固定液流失），並有清晰的界面。當樣品進入色譜柱時，溶質分布在兩相之間。
當達到平衡時，它遵循以下等式：其中 cs - 固定相中的溶質濃度；cm - 流動相中的溶質濃度；Vs - 固定相的體積；Vm - 流動相的體積。LLPC 與 GPC 有相似之處，即分離順序取決於 K，K 大的組分保留值大；但也有不同之處，在 GPC 中，流動相對 K 的影響很小，而 LLPC 流動相對 K 的影響很大。
a. 正相液相色譜法（Normal Phase liquid chromatography）：流動相的極性小於固定液的極性：流動相的極性大於固定液的極性。
c. 液液分配色譜法的缺點：雖然流動相和固定相的極性要求完全不同，但固定液仍會輕微溶解在流動相中；流動相通過色譜柱時的機械沖擊會造成固定液的損失。20 世紀 70 年代末開發的化學鍵固定相（見後文）可以克服上述缺點。
目前已得到廣泛應用（70%~80%）。2 .液-固色譜法 流動相為液體，固定相為吸附劑（如矽膠、氧化鋁等）。
這是根據物質的不同吸附性來進行分離的。其機理是：當樣品進入色譜柱時，溶質分子（X）和溶劑分子（S）在吸附劑表面的活性中心競爭吸附（未進入樣品時，吸附劑的活性中心全部吸附 S），可表示如下：Xm + nSa ====== Xa + nSm 式中Xm--流動相中的溶質分子； Sa--固定相中的溶劑分子； Xa--固定相中的溶質分子； Sm--流動相中的溶劑分子。
當吸附競爭反應達到平衡時：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 其中：K 是吸附平衡常數。[討論：K 越大，保留值越大。
] 3 .
離子交換色譜法的原理是離子交換樹脂上的可電離離子與流動相中電荷相同的溶質離子進行可逆交換，根據這些離子對交換劑的不同親和力將其分離。 [X-] = KX [-R4N+Cl-]/[Cl-] [討論：DX 與保留值之間的關系] 任何能在溶劑中電離的物質通常都能用離子交換色譜法分離。4 .離子對色譜（Ion Pair Chromatography） 離子對色譜（IPC）是通過在流動相或固定相中加入壹個（或多個）與溶質分子電荷相反的離子（稱為離子對或反離子），使其與溶質離子結合形成壹對疏水離子化合物，從而控制溶質離子的保留行為。
原理可用下式表示：X + 水相 + Y - 水相 === X + Y - 有機相 其中：X + 水相--待分離有機離子（也包括陽離子）的流動相；Y - 水相--離子對電荷相反的流動相（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲基銨等）；X + Y --形成。
液相色譜儀的使用及工作原理
工作原理：流動相通過輸液泵流經進樣閥，與樣品溶液混合，流經色譜柱，在色譜柱中吸附、分離，最後各組分被檢測器轉化為信號，在色譜工作站上出現相應的色譜峰。
液相色譜的使用方法：首先對樣品進行預處理，然後進樣，進樣完成後，清洗進樣口，每次分析結束後，清洗通道，最後關閉儀器。
擴展資料：
液相色譜所用的基本理論：塔板理論和速率方程也與氣相色譜基本相同，但由於氣相色譜是以液體而不是以氣體作為流動相，而且液體和氣體的性質也不壹樣。此外，液相色譜所用的儀器和操作條件也與氣相色譜不同，因此液相色譜與氣相色譜存在壹些差異。
主要表現在以下幾個方面：操作條件和適用範圍不同 對於氣相色譜來說，它是加熱操作。只能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質，對高沸點化合物、非揮發性物質、熱不穩定化合物、離子化合物和高分子分離、分析比較困難，致使其應用受到壹定程度的限制，據統計，只有約20%的生物體可采用氣相色譜法進行分析。
液相色譜是室溫操作，不受樣品揮發性和熱穩定性的限制，它非常適合於相對分子量大、不易汽化、不易揮發或對熱敏感的物質、離子化合物和高分子化合物的分離分析，約占有機物的70%～80%。氣相色譜流動相載氣是色譜惰性氣體，基本上不參與分布平衡過程，與樣品分子沒有親和力作用，樣品分子主要與固定相作用。
而在液相色譜中，流動相液體也會與固定相競爭樣品分子，增加壹個提高選擇性的因素。還可以選擇兩種或兩種以上液體的不同比例作為流動相，以提高分離的選擇性。
b.液相色譜固定相種類較多，如離子交換色譜和排阻色譜等，隨著分析的進行，選擇余地較大；而氣相色譜則不可能。 c.液相色譜通常在室溫下操作，溫度較低，壹般有利於色譜分離條件的選擇。
③ 由於液體的擴散性比氣體小105倍，因此溶質在液相中的傳質速率較慢，柱外效應尤為重要；而在氣相色譜中，柱外區引起的擴張可以忽略不計。④ 在液相色譜中，樣品的制備簡單，樣品的回收較容易，且回收定量，適合大量制備，但液相色譜仍缺乏通用的檢測器，加之較為復雜，價格昂貴。
在實際應用中，這兩種技術是相輔相成的。綜上所述，液相色譜法具有柱效高、選擇性高、靈敏度高、分析速度快、重復性好、應用範圍廣等優點，該方法已成為現代分析技術的主要手段之壹。
目前，它已廣泛應用於化學、化工、醫藥、生化、環保、農業等科學領域。高效液相色譜應用廣泛，幾乎遍及定量和定性分析的各個領域。
（1）分離混合物 高效液相色譜只需將樣品制成溶液即可，不受樣品揮發性的限制，流動相可選擇的固定相範圍廣、種類多，因而可以分離熱不穩定和非揮發性、解離和非解離以及各種分子量範圍的物質。高效液相色譜法具有高分辨率和靈敏度，結合樣品前處理技術，可以分離和同時測定性質非常相似的物質，並分離復雜混合物中的痕量成分。
而且隨著固定相的發展，還可以在充分保持生化物質的條件下完成它們的分離。(2）生化分析 由於高效液相色譜具有分辨率高、靈敏度高、速度快、色譜柱可反復使用、流出組分易於收集等優點，因而被廣泛應用於生物化學、食品分析、藥物研究、環境分析、無機分析等領域，成為解決生化分析問題最有前途的方法。
（3）儀器耦合 高效液相色譜與結構儀器耦合是壹個重要的發展方向。高效液相色譜與質譜聯用技術已受到普遍重視，如在氨基甲酸酯類農藥和多核芳烴的分析中：高效液相色譜與紅外光譜聯用發展很快，如在環境汙染分析中測定水中的碳氫化合物等。
參考文獻：
液相色譜法的原理是什麽？它有什麽用途？
液相色譜的原理：儲液器中的流動相由高壓泵泵入系統，樣品溶液通過進樣器進入流動相，被流動相裝入色譜柱（固定相）。由於樣品溶液中的各組分在兩相中的分配系數不同，因此在兩相中經過反復的吸附-解吸分配相對運動後，各組分會因運動速度的巨大差異而被分離成單個組分。經過反復的吸附-解吸分配過程，各組分的運動速度相差較大，被分離成單個組分依次流出色譜柱，通過檢測器，樣品的濃度被轉換成電信號傳輸到記錄器，數據以圖表的形式打印出來。
主要用於高沸點、難氣化化合物的混合物通過柱芯洗脫液而實現分離。應用於生物化學、生物醫藥、環境化學、石油化工等部門。
擴展資料 液相色譜儀按固定相是液體還是固體，又分為液-液色譜（LLC）和液-固色譜（LSC）。現代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統、溫控系統、色譜柱、檢測器、信號記錄系統等部件組成。
與經典的液相柱層析裝置相比，它具有高效、快速、靈敏的特點。高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統。
進樣系統壹般采用隔膜進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量恒定。這有利於提高分析樣品的重現性。
輸液系統 該系統由三部分組成：高壓泵、流動相儲罐和梯度儀。高壓泵的壹般壓力為 l.47~4.4X10Pa，流量可調且穩定。當高壓流動相通過色譜柱時，可降低樣品在色譜柱中的擴散效應，加快其在色譜柱中的移動速度，有利於提高分辨率、回收樣品和保持樣品的生物活性。
分離系統該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器。色譜柱長度壹般為 10 ～ 50cm（需兩根相連，兩根之間可加壹根連接管），內徑為 2 ～ 5mm，由 "優質不銹鋼管或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，內住裝有粒徑為 5 ～ 10μm 的固定相（由基質和固定液組成）"。