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細胞工程的發展歷史和細胞工程的應用細胞工程的應用細胞工程的發展歷史和細胞工程的應用

(1)微繁殖技術(Micropropagation)的應用

微繁殖技術,即以植物器官、組織、細胞或原生質體為外植體,在體外培養條件下進行植物再生的技術。應用微繁殖技術,可以克服高度雜合物種有性繁殖造成的後代嚴重分離問題,如澳大利亞的木瓜;可以用於名貴或瀕危物種的快速繁殖,如菠蘿、草莓等。通過微繁殖技術再生的樹種有木瓜、柑橘、龍眼、荔枝、蘋果、梨、葡萄等。草莓、香蕉等已實現商業化。

通過莖尖培養或微嫁接技術,可以去除植物體內的病毒,獲得無病毒苗,如蘋果、草莓等。此外,在組織培養過程中,如愈傷組織培養、細胞懸浮培養、原生質體培養等,通過pH值、溫度、離子濃度等條件的變化,可增加其變異性,從中篩選出優良的突變體,從而為新品種選育開辟壹條新途徑。

愈傷組織、懸浮細胞、原生質體等是基因轉化的良好受體材料,離體培養條件下的植物再生也是實現植物基因轉化的重要環節。

此外,微繁殖技術還為種質資源的保存提供了壹種新方法。許多種質資源在離體培養條件下,通過減緩生長速度和低溫處理,可以長期保存,並在不同國家和地區進行收集、交換、保存和應用,即建立 "基因庫",實現種質資源的全球****sharing。例如,比利時天主教大學魯汶研究中心就擁有大量體外保存的香蕉種質資源庫。

(2)細胞大量培養和有用次生代謝物的生產

細胞大量培養有用次生代謝物是植物細胞工程的另壹個重要應用領域。通過細胞工程技術,刺激植物體內某些重要次生代謝產物的合成和積累,然後進行分離純化,如某些有價值的藥物、香料、色素等,從而實現植物產品的工業化生產。

早在1964年,我國就開始了人參細胞培養。1980年,我國科研人員相繼開展了紫草、三七、白頭翁、青蒿、紅景天和水母雪蓮等壹大批植物的細胞大量培養和研究,並利用生物反應器開展了大量藥用植物細胞培養的中小型試驗。其中,新疆紫草中試規模已達 100L,並開展了紫草素的小批量生產,用於化妝品和抗菌、抗病毒、抗腫瘤藥物的開發。紅豆杉細胞的大規模培養在我國也取得了初步成功,從細胞培養物中獲得了珍貴的抗癌藥物紫杉醇,但收率還有待提高。

(3)單倍體技術的應用

單倍體育種及相關研究已廣泛應用於農業和園藝植物領域。隨著 Blakeslee 等人(1922 年)和 Kostoff(1941 年)分別獲得單倍體植物單倍體,有利於突變的檢測和抗性細胞系的篩選,大大縮短了育種時間。此外,單倍體在基因圖譜繪制和基因轉移研究中也發揮著重要作用。

自然發生的單倍體非常罕見,僅限於少數幾種植物。花藥培養是單倍體形成的重要途徑。自1964年首次成功進行花藥培養以來,花藥培養技術取得了顯著進展,特別是在水稻、小麥、玉米等作物上獲得了巨大成功。取得成功的果樹品種主要有番瀉葉(Nair 等,1983 年)、木瓜(Litz 和 Conover,1978 年)、四個柑橘品種(陳,1985 年)、龍眼(楊和魏,1984 年)、荔枝(傅和唐,1983 年)、蘋果(張等,1990 年)、梨(Jordan,1975 年)、葡萄(Rajasekaran 和 Mullins,1979 年)等。薛光榮等人(1980 年)從東方草莓(四倍體)的單倍體階段培養花粉,成功誘導出單倍體植株。

花藥培養主要受基因型、花藥發育階段、預處理和培養條件等因素的影響,其主要問題是單倍體誘導的頻率低,以及難以區分單倍體自發加倍形成的二倍體和體細胞組織形成的二倍體。例如,Fowler 等人(1971 年)、Nishi 等人(1974 年)和 Rosati 等人(1975 年)從八倍體草莓花藥中誘導出愈傷組織並分化植株,結果發現再生植株仍然是八倍體,而且很難區分這些八倍體是由無性器官發育而來還是由單倍體自發加倍形成的。

除花藥培養外,植物的卵母細胞、輔助細胞和對節細胞等單倍體細胞也可通過離體培養分化成單倍體胚或愈傷組織。胚珠和子房的培養也嘗試過很多次,但大多數情況下都是在愈傷組織階段停止生長。

(4)胚培養(胚胎培養)

胚的離體培養是最早直接應用於植物改良的組織培養技術。胚培養可以克服雜交後胚的衰亡,保證種內或種間雜交的成功,也可用於難以培養的植物的無性繁殖。Magdalita等人(1996年)和Drew等人(1997年)進行了木瓜的種內雜交,在獲得合適的胚後,進行了胚培養以促進雜交成功。Jordan(1992年)獲得了愈傷組織,但沒有獲得再生植株。

澳大利亞國際農業技術研究中心(ACIATR)對木瓜及其野生種的雜交胚胎進行了培養研究,並取得了成功,獲得的雜交後代繼承了野生種的抗性和高含糖量等優良性狀。荔枝是較難進行體外培養的果樹品種之壹,Kantharajah 等人(1992 年)培養出了長度為 3 毫米的荔枝幼胚。通過未成熟胚培養再生的其他樹種包括鱷梨、荔枝和木瓜。姚強(1990 年)通過培養桃、油桃和番瀉葉死後 60 d 的未成熟胚,獲得了再生植株。

(5)原生質體培養和體細胞雜交

原生質體是去除了細胞壁的單細胞,是能夠在體外培養條件下再生出完整植株的最小單位。每個原生質體都包含個體的所有遺傳信息,並能在適當的培養條件下再生出與其親本相似的個體。原生質體培養的主要目的是通過原生質體的融合,克服遠緣雜交的障礙,實現體細胞雜交,從而產生雜交後代。在原生質體培養過程中,往往會產生大量的突變,從中可以篩選出優良的突變體。原生質體可以攝取各種大分子遺傳物質,如外源細胞器、病毒、DNA 等,是遺傳轉化的理想工具。此外,同時獲得的大量原生質體在遺傳上具有同質性,可以為細胞生物學、發育生物學、細胞生理學、細胞遺傳學和其他壹些生物學學科建立良好的實驗體系。

Lizz(1986 年)分離了木瓜的原生質體,Krikorian 等人(1988 年)分離了香蕉的原生質體,但都沒有獲得持續分裂的細胞。(1992 年,他們從草莓試管苗的嫩葉和葉柄原生質體中獲得了再生植株。Infante 等人從森林草莓(Fragaria vesca)高山營養系試管苗的葉片和葉柄中分離出原生質體,並獲得了再生植株。愈傷組織和懸浮細胞是制備原生質體的重要材料,但在落葉果樹中,只有少數樹種利用愈傷組織或懸浮細胞分離原生質體並獲得成功的培養物,其中最成功的是獼猴桃。蔡啟貴等(1988 年)利用愈傷組織從中國獼猴桃中分離出原生質體並獲得再生植株,Kovalenko 等(1990 年)和 Ochatt 等(1988 年)分別利用懸浮細胞系在柯爾特櫻桃和歐洲葡萄上分離出原生質體並獲得再生植株。

林定波等(1997 年)以胚胎愈傷組織為材料,分離出金橘的原生質體,並獲得了再生植株。Yi Ganjun等(1997)也以胚愈傷組織為材料分離出了柑橘(洪江橙)的原生質體,並獲得了再生植株。然而,以葉肉為材料獲得的原生質體的分離並不成功。Ma Fengwang 等人(1998 年)分離並培養了山杏的原生質體。在適宜的條件下,山杏原生質體在 4~5d 內變形,5~6d 開始第壹次分裂,20d 左右可形成 15~20 個細胞的小細胞團,60d 後可形成肉眼可見的微愈傷組織。微愈傷組織可誘導不定芽和不定根,連續培養後可形成完整植株。丁愛萍等(1994)研究了蘋果的原生質體培養和植株再生,以胚性愈傷組織建立的懸浮細胞系為材料,分離原生質體,獲得再生植株。

植物細胞去掉細胞壁後,可以像受精過程壹樣相互融合,實現常規雜交中無親緣關系的親本之間遺傳物質的重組,從而開辟了體細胞雜交的新領域。體細胞雜交已廣泛應用於植物育種,在細胞質雄性不育、抗病性等方面取得了顯著進展。同時,在木本果樹植物中也獲得了具有經濟價值的體細胞雜交植株。

目前最有效的兩種融合體系是 PEG--高 pH/Ca2+ 法和電擊融合法。

第壹個體細胞雜交是通過番茄和馬鈴薯的原生質體融合實現的。Ohgawary 將甜橙的原生質體與飛龍的原生質體融合,獲得了體細胞雜交植株。

美國學者格羅瑟(Grosser)將甜橙懸浮培養細胞的原生質體與Severinia disticha胼胝體組織的原生質體融合,獲得了屬間異源四倍體的體細胞雜交植株。S.distcha具有抗病、耐寒、耐鹽等優良性狀,適合用作柑橘的砧木。

(6)轉化

分子生物學的飛速發展引發了植物科學的新革命。經過多年的探索,人們從分子水平上對生物學和遺傳學有了深刻的認識,結合組織培養技術,分子生物學技術開始應用於植物基因組的修飾和改變。

由於基因編碼的同壹性,任何生物體(如病毒、真菌、昆蟲)中的有用基因都可以轉移到植物體內。基因(如抗蟲或抗病基因)的引入會導致新基因型的出現,或實現基因型的改良,從而可以選擇抗蟲或抗病的基因型。

已分離或應用的目標基因主要包括抗植物病蟲害基因、抗非生物脅迫基因、提高作物產量和質量的基因以及改變植物其他性狀的基因。

將外源基因導入植物細胞的方法有多種,如農桿菌質粒介導法(包括 Ti 質粒的 Ri 質粒)、植物病毒載體介導法、DNA 直接導入法(包括 PEG 介導法、脂質體介導法等化學誘導 DNA 直接轉化法,電刺激、超聲波、微註射、激光微束、基因槍等物理誘導 DNA 直接轉化法等)和種質系統介導法。)和種質系統介導法。(如電激勵、超聲波、微註射、激光微束、基因槍等)和種質系統介導的基因轉化(包括花粉管導入、生殖細胞浸泡、囊胚和卵巢註射等)。目前,最常用、最有效的方法是根瘤農桿菌介導法和基因槍法。自 1983 年農桿菌介導法首次在煙草和馬鈴薯上獲得成功以來,已有約 120 種植物通過這種方法進行了轉化。農桿菌介導法對雙子葉植物非常有效,但也開始用於單子葉植物。基因槍法既能以愈傷組織為受體,也能以懸浮細胞為受體,對單子葉植物和雙子葉植物都非常有效。(1)快速繁殖優良、瀕危品種和新品種

借用胚胎提高種群利用率。20 世紀 30 年代,胚胎移植在綿羊和山羊身上獲得成功;1982 年,美國學者獲得了世界上第壹頭試管牛。通過體外受精、細胞核移植技術、胚胎分割、胚胎融合等技術達到快速繁殖的目的,還可以培育出高產奶牛、瘦肉型豬等新品種。大熊貓、東北虎等珍稀動物的繁育就是通過胚胎工程和克隆技術實現的。

(2)利用動物細胞培養生產活性產品、藥物

主要是各種疫苗、抗體等。1975年,英國劍橋大學首次利用動物細胞融合技術獲得單克隆抗體。先後啟用 300L 和 1000L 培養槽生產單克隆抗體和灰白質脊髓炎疫苗等。20 世紀 90 年代國際上興起了壹種以活細胞為治療劑的 "活細胞療法",主要是在體外繁殖病人的自體細胞,使其擴增或產生治療物質,然後註入體內,治療癌癥、白血病、血癌等疾病的方法。該方法對癌癥、白血病、糖尿病、燒傷、艾滋病等有潛在的治療作用。

(3)用於醫學器官修復或移植的組織工程

利用細胞工程技術,使人體殘存器官的少量正常細胞在體外繁殖,從而獲得患者所需的器官,且功能相同,無排異反應,僅用於器官移植。例如,壹些骨骼、軟骨、血管和皮膚正在實驗室中培育,肝臟、胰腺、心臟、乳房、手指和耳朵也正在實驗室中培育成型。

(4)轉基因動物的生物反應器

與傳統的動物細胞培養相比,轉基因動物制藥技術效果顯著,轉基因動物就是天然的基因藥物制造工廠。1992 年,上海醫學遺傳研究所培育出中國第壹頭攜帶人類蛋白質基因的轉基因試管牛。2000 年,中國培育出攜帶人類α-抗胰蛋白酶基因的轉基因奶牛。2000 年,我國培育出攜帶人 α 抗胰蛋白酶基因的轉基因山羊,可從轉基因山羊的乳汁中提取α抗胰蛋白酶治療慢性肺氣腫、先天性肺纖維化囊腫等疾病。為了獲得能分解利用纖維素水解物並高效生產乙醇的菌株,研究人員將利用纖維生物糖能力強的白色念珠菌(Candida abtusa)與生產乙醇率高的發酵接合糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)進行融合,融合得到的菌株不僅以纖維生物糖為唯壹碳源,而且生產乙醇的能力也高於親本。

將綠孢鏈黴菌 TTA 和麥角鏈黴菌 75viz 融合,得到的四株菌株降解玉米莖纖維素的能力比親本高出 155% 至 264%。

用電融合法融合釀酒酵母和五聯假單胞菌,篩選出既能利用木糖又能利用纖維二糖生產乙醇的菌株,這對纖維素再生資源的利用和減少環境汙染具有重要意義。

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