新建成的無菌生產線只有連續三次成功地通過培養基灌裝後，才能投入生產使用。
無菌生產工藝是制藥領域難度最大的工藝之壹。由於許多藥品無法最終滅菌, 它們在進行配制、灌裝等暴露作業時就必須盡可能避免被微生物汙染。而影響產品是否無菌的因素相當多, 諸如生產區的設計及其設備布局、生產時的環境狀況、所有與生產相關的設備及物料的汙染狀況、人員操作和衛生狀況等, 每壹個環節對最終產品的質量都舉足輕重。為了確保無菌生產工藝系統無菌的可靠性和適應性, 需通過壹定的驗證方法來對其進行驗證。多數廠家采用培養基灌裝試驗來證明其無菌工藝的可靠性。2010版GMP附錄1《無菌藥品》第四十七條明確規定：“培養基灌裝容器的數量應當足以保證評價的有效性。批量較小的產品，培養基灌裝的數量應當至少等於產品的批量。培養基模擬灌裝試驗的目標是零汙染，應當遵循以下要求： (壹）灌裝數量少於5 0 0 0支時，不得檢出汙染品。 (二）灌裝數量在5 0 0 0至10000支時： 1 .有1 支汙染，需調查，可考慮重復試驗； 2 .有2 支汙染，需調查後，進行再驗證。 (三）灌裝數量超過10000支時： 1 .有1 支汙染，需調查； 2 .有2 支汙染，需調查後，進行再驗證。 (四）發生任何微生物汙染時，均應當進行調查。” 1 培養基灌裝試驗的前提條件 首先, 所有的相關設備及其工藝均應事先通過確認或驗證, 如潔凈生產區環境須通過靜態驗證(空氣的懸浮粒子、浮遊菌、沈降菌及表面微生物均應符合相應的規定) , 操作人員的衛生及其操作行為均須經過嚴格的培訓, 生產主要設備(如灌裝機、凍幹機等) 以及與生產相關的其它輔助工藝(如淋洗、濕熱滅菌、幹熱滅菌去熱源、除菌過濾等) , 均須通過確認或驗證。 2 培養基灌裝試驗 2. 1 培養基的選擇 為了盡可能地檢出無菌生產工藝系統中可能會給實際產品造成汙染的微生物, 所選用的培養基應盡可能適應廣譜微生物的生長, 包括細菌、黴菌和酵母菌等。驗證試驗前, 可用下述方法來鑒別驗證用培養基的可行性。首先嚴格按照培養基生產商的要求進行配制和滅菌, 然後將無菌培養基分裝至壹定數量的無菌小瓶或試管內。同時, 制備好三種微生物[ 枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(S tap hy lococcus au reus) 和白色念珠菌(Cand id a a l2bicans) ]的懸浮液, 菌液濃度控制為100～ 1000 個菌/ml。 將上述準備好的無菌培養基分成三等份, 且每份至少兩瓶(支) , 分別加入上述菌懸液各0.1 m l。將接有枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的培養基於30～ 35℃下培養, 接有白色念珠菌的培養基於20～25℃下培養。如果在7 d 內, 每種微生物培養基均至少有50% 長菌, 則認為該培養基可用於無菌工藝驗證試驗。實踐證明, 營養肉湯培養基或大豆胰蛋白腖液體培養基( soybean2casein digest medium ) 均適用於培養基灌裝試驗。 2. 2 培養基灌裝試驗的頻率 新建的或生產工藝進行過重大更改後的無菌工藝生產線, 必須經至少連續三批合格的培養基灌裝試驗後方可證明被驗證工藝的可靠性。常規生產條件下的再驗證頻率, 每年至少兩次,每次至少灌裝壹批。由於不同時間的氣候狀態不同, 務必考慮對實際生產操作的每個班次進行培養基灌裝試驗。如果因培養基灌裝試驗不合格而重新灌裝時, 灌裝時間(班次) 要與初始灌裝的時間(班次) 相同。 2. 3 灌裝體積和灌裝數量 壹般來說, 每只容器的灌裝體積不得少於其容積的三分之壹 , 這樣才能保證有足夠數量的培養基與容器的內表面充分接觸並且易於觀察到微生物的生長狀況。確定培養基的灌裝數量時須考慮以下兩個主要因素。壹是應符合統計學要求, 即在95% 的置信限至少能檢出千分之壹的汙染率; 二是被驗證工藝的日常實際生產批量。因為實際生產批量與無菌工藝操作所持續的時間和灌裝速度密切相關, 而培養基灌裝的持續時間應足以涵蓋實際生產條件下的全部操作, 並且培養基的灌裝數量應能反映出在等於或小於實際生產的灌裝速度下產品及容器所暴露時間“最差狀況”。因此, 當某無菌生產線的實際生產批量大於5000 瓶時, 則培養基的灌裝批量不得少於5000 瓶,當無菌生產線的實際生產批量最多不超過5000 瓶時, 則按日常最大批量灌裝即可。 2. 4 無菌培養基的制備 對於產品溶液與培養基溶液配制方法相似的無菌生產線來說, 用培養基替代產品組分完全模擬實際生產時的配液操作進行培養基配制(按培養基生產商的要求)、除菌過濾、並將除菌後的培養基溶液接入壹無菌接收罐。對於那些產品溶液配制方法與培養基溶液配制方法不同或是生產粉針劑的無菌生產線來說, 可按照下述方法配制無菌培養基。在潔凈區內, 將事先稱量好的培養基加入壹無菌的潔凈配制罐內, 按照培養基生產商的要求配制培養基溶液。在無菌環境下,用無菌管路將配制罐通過壹已滅過菌的裝有0. 22μm濾膜(或濾芯) 的過濾器與壹無菌的儲罐(儲罐頂部的通氣口應配有0. 2 μm 的疏水性過濾器) 連接起來, 通過加壓或減壓將培養基溶液經除菌過濾後轉移至無菌儲罐內。過濾結束後, 檢查除菌過濾器的完好性, 如果檢查結果合格, 則無菌培養基制備完成。 2. 5 無菌灌封 模擬實際灌裝作業進行培養基灌裝。灌裝容器及膠塞應盡可能與常規生產時壹致。灌裝時, 最好能模擬實際生產時的最差狀況, 如設備維修、操作人員的更換等, 以掌握在實際生產條件下產品汙染的真實資料。對粉針劑生產線而言, 為了驗證實際生產狀態下的粉末灌裝, 可用適當的無菌粉末模擬灌裝, 再向瓶內註入無菌培養基。用於驗證試驗的粉末要求流動性好、易溶於培養基並且沒有抑菌作用, 如乳糖或甘露醇等; 粉末滅菌可采用輻射滅菌法或環氧乙烷滅菌法; 灌裝時, 每瓶內的粉末量不宜過多, 否則會對培養基溶液的促菌生長造成不良影響, 實踐證明,每5 m l 液體培養基內乳糖含量不宜超過0. 3 g。對水針劑而言, 灌裝培養基後可直接壓塞。對凍幹劑而言, 灌裝後, 只進行半壓塞, 模擬實際操作將半壓塞瓶轉移至凍幹機內。培養基的冷凍溫度不得低於3℃, 因為溫度過低會使壹些微生物死亡或受到損傷, 造成汙染水平降低的假象, 就不能如實反映無菌工藝的實際無菌水平。模擬凍幹時, 適當進行部分真空和充氮保護模擬(請註意, 真空度不宜過高,否則會引起培養基暴沸; 充氮過量會抑制需氧性微生物的生長)。凍幹結束後, 在腔室內全壓塞, 然後卸出並轉移至壓蓋間壓蓋。將壓完蓋的培養基上下顛倒幾次以使培養基與膠塞及整個容器內壁充分接觸。從壓塞至最終的培養檢查, 應將盛裝培養基瓶的托盤容器做好標記, 以便對所出現的偏差進行追溯。 2. 6 培養和計數 將壓好蓋的培養基先置於20-25℃培養至少7天，然後在30！35繼續培養7天。培養期間, 可定期對灌裝培養基進行目檢, 記下每次檢出的汙染瓶數及出現汙染菌的相應托盤編號。檢查時將每瓶培養基在有白色光源的黑色背景下仔細目測。透明、澄清、無混濁的培養基判為無微生物生長; 如培養基混濁或有懸浮的菌絲或菌落, 則需作進壹步的微生物生長檢查, 以確定培養基是否真正染菌。對已確定有微生物生長的培養基瓶進行仔細檢查, 看其中是否有破損, 有破損的培養基瓶不得納入最終的結果評價。每批灌裝培養基的汙染率可按下式計算:
汙染率% = 汙染的培養基瓶數×100/(灌裝總瓶數- 破損瓶數) 2. 7 汙染菌的鑒別 將培養基瓶中的汙染菌在適當的培養基(如大豆胰蛋白腖瓊脂、營養瓊脂等) 上劃線和分離培養。挑取單個菌落進行形態學觀察、革蘭氏染色等初步鑒別。如果需要對培養基灌裝結果作進壹步調查, 那麽將汙染菌鑒別到種, 這對偏差調查將起到非常關鍵的作用。尋找汙染菌與其它資料(如環境監控資料) 間的相關性是無菌工藝偏差調查的有效手段。 2. 8 培養基靈敏度檢查 從每批灌裝好的培養基中隨機抽取適量培養基, 按照中國藥典(或美國藥典) 無菌檢查法中的培養基靈敏度檢查法, 分別向培養基中接入下列試驗菌懸液, 每個菌株至少接種兩瓶灌裝培養基, 每瓶接種量為10～ 100 個菌。 表1 培養基靈敏度試驗用微生物 微生物名稱 菌株編號 培養溫度（℃） 金黃色葡萄球菌1 CMCC（B） 2603 30-35 藤黃微球菌2 CMCC(B) 28001 30-35 白色念珠菌 CMCC(F) 98001 20-25 黑曲黴菌 ATCC 16404 20-251可用枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)A TCC 6633 替代; 2可用銅綠假單胞菌(P seud om onas aerug inosa)A TCC 9027 替代。 將接有上述微生物的培養基置於相應溫度下培養, 每種菌株在7 d 內應至少有壹瓶出現明顯生長,否則可復試壹次。如果靈敏度檢查結果不合格, 該批培養基灌裝試驗無效, 須重新試驗。
2. 9 環境控制 無菌生產區的環境確認和驗證是無菌生產工藝驗證的前提條件。而培養基灌裝時的環境監控資料對整個工藝驗證的評價和偏差分析將起到非常關鍵性的作用。培養基灌裝時的環境監控項目及取樣數量均不得少於常規生產時的監控項目和取樣數量。將日常的環境監控資料匯總, 並與培養基灌裝時的環境監控資料以及培養基灌裝結果相結合進行趨勢分析, 不僅能對企業所執行的清潔、消毒方案以及人員衛生規範作出客觀評估, 而且可以為合理制定適合於本企業內部的環境控制標準(警戒標準和糾偏標準) 提供依據。
2. 10 合格標準和汙染概率 培養基灌裝結果的評價是無菌生產工藝驗證中的壹個焦點。由於對合格標準的理解存在差異, 同壹個數據往往會導致不同的結論。美國藥典(U SP 24)對無菌藥品的汙染率作如下規定:
最終滅菌藥品的無菌保證水平(SAL ) 不得低於10- 6, 即汙染率不得超過百萬分之壹; 無菌灌裝藥品的無菌保證水平(SAL ) 不得低於10- 3, 即汙染率不得超過千分之壹。
實踐證明, 對設計合理並且生產操作環境得到良好控制的無菌生產線而言, 其產品汙染率維持在千分之壹以內並不難。企業須通過培養基灌裝試驗來證明其無菌生產線所生產的無菌產品的汙染概率始終維持在這壹水平下。值得註意的是, 驗證結果表明無菌保證水平達到10- 3, 並不表示藥政部門允許上市產品每1000 瓶中可以有1 瓶是汙染品。相反, 這只不過是通過驗證數據計算出的可接受的汙染概率的理論值。
3 偏差調查及糾偏措施 驗證試驗結果不合格是無菌工藝驗證中的最大難題。這需要進行大量的偏差調查並采取有效的糾偏措施。根據實際經驗, 在此列出了壹套出現偏差後的調查方法及糾偏措施。 3. 1 偏差調查 1) 檢查所有與培養基灌裝用物品相關滅菌設備的驗證資料和滅菌記錄; 2) 檢查培養基灌裝時的環境監控資料, 包括空氣懸浮粒子、浮遊菌、沈降菌、表面微生物以及操作人員的衛生監測資料; 3) 將培養基中汙染菌和環境監測時所監測到的微生物逐壹鑒定到種, 並比較各個汙染菌彼此間的相關性; 4) 檢查相關產品無菌試驗結果呈陽性的歷史資料, 看其汙染菌與培養基驗證試驗中的汙染菌是否壹致; 5) 檢查以往的培養基灌裝資料, 看其中的汙染菌是否重復出現; 6) 檢查培養基灌封用容器及膠塞的完好性; 7) 檢查培養基灌裝時無菌潔凈區的壓差記錄,是否符合常規; 8) 檢查培養基灌裝時的維修和清潔記錄; 9) 檢查培養基灌裝時的批生產記錄和設備運行記錄等。 3. 2 糾偏措施 務必要仔細回顧和分析所有的培養基灌裝資料及其相關資料, 以準確找出本次偏差的真正原因。盡管環境監測時能監測到微生物, 但多數情況下, 也很難發現其與實際偏差有直接的相關性。壹旦出現偏差並完成其調查後, 須立即實施糾偏計劃。以下列出了壹些在實施糾偏計劃時的基本操作程序。 1) 增加培養基的灌裝數量和環境監測數據以查明汙染源; 2) 加強無菌生產環境的清潔和消毒措施; 3) 增加灌裝前靜態下的環境監測數據以檢查無菌環境條件的可靠性; 4) 用培養基中的汙染菌對消毒劑進行挑戰性試驗, 以檢查汙染菌是否對消毒劑有耐受性; 5) 分別於灌裝前、灌裝時及灌裝後, 增加對操作人員的衛生監控(手套表面微生物和操作服表面微生物) ; 6) 增加培養基的灌裝批次, 以檢查所出現的偏差是否具有偶然性。 4 小結 我國目前已經建立無菌生產工藝的無菌保證標準和驗證標準, 隨著與國際接軌的需要, 我們須了解和掌握國外的先進技術、標準和經驗, 才能加快提高我國藥品在國際市場上的競爭力, 增加藥品出口。本文重點介紹的培養基灌裝試驗只是無菌生產工藝驗證中的壹種方法, 反映了該領域在當今國際上的先進水平和要求。但是, 由於無菌工藝本身的多樣性和復雜性, 很難對其中的每個細節面面俱到, 文中僅對培養基灌裝試驗中常見的***性問題進行了闡述。
參考資料：
2、 無菌生產工藝驗證——培養基灌裝試驗