本方法適用於各種植物組織、器官及其制劑(如葡萄籽提取物、松樹皮提取物等)中原花青素含量的測定。
1.方法概述
原花青素(又稱縮合單寧)是黃烷-3-醇的低聚物和聚合物,屬於多酚類化合物。與其他酚類化合物不同的是,黃烷醇(縮合單寧、單體、二聚體等)在酸性介質中能與香蘭素反應生成有色物質,其最大吸收波長為 500 nm,可用比色法測量。
2.儀器
分光光度計。
3.試劑
使用的水是去離子水或純度相當的蒸餾水。
(1)香蘭素、甲醇和濃鹽酸均為分析純。
(2)純化的原花青素或兒茶素。
(3)4%的香蘭素甲醇溶液。
(4)標準使用液:將純化的原花色素溶於蒸餾水制成 1mg/mL 的儲備液,再將儲備液稀釋至 1×10-2mg/mL 的濃度,制成 1mg/mL 的標準使用液。標準使用溶液應在測量當天配制。
如果沒有純化的原花色素,可用兒茶素代替,配制方法同上。
4、測定步驟
(1)樣品中原花色素的制備:將植物材料用4倍體積的丙酮+水(7+3,v/v)或60%甲醇提取,40℃減壓蒸餾除去有機溶劑,水相用乙醚洗滌後定容。
凍幹固體原花色素制劑,直接溶於水(先加入少量甲醇助溶)制成原花色素液體。
花色素原液置於 5℃暗處保存備用。
(2)樣品的測定:用錫箔紙將試管(14mm×20mm)包緊,只留管口供加樣用。在試管中加入 0.5mL 樣品,然後加入 3.0mL 4%香蘭素甲醇溶液,再加入 1.5mL 濃鹽酸,充分混勻,室溫下顯色 15min。最後在 500nm 波長下進行比色。
根據上述步驟可制成標準曲線(即 0.1mg 原花色素在 500nm 處的吸收值為 0.55)。
5.計算結果
原花色素量的計算公式,
原花色素(1×10-3mg)=A500nm÷0.55×100×V
式中,V--試樣的稀釋體積(倍)。
6、註意事項
(1)本方法的檢測範圍為(5~500)×10-3mg/0.5mL 樣品溶液。精密度和準確度均大於 1×10-3mg。
(2)反應試管應在洗滌劑中浸泡 24h 並徹底清洗。
(3)比色時,用水作空白。
(4)500 納米波長處的 OD 值應控制在 3 以下。
(5)當樣品中的原花色素含量較高時,應從有香蘭素時測得的 A500nm 值中減去無香蘭素時測得的值。
(6)顯色液應避光保存。
還有 PH 差值法
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