除此之外，妳的問題本身，如上所述，蛋白質樣本可以反復凍融的次數取決於目標蛋白質的性質(主要是穩定性)。這意味著，如果妳需要的目標蛋白比較穩定，可以反復凍融，但最好不要反復凍融三次以上，因為蛋白質在反復凍融下會變性，保存太久也會影響實驗數據的準確性。壹般來說-20度存放不超過2周，最長不超過1個月；-80度(或-70度)儲存，壹般不超過半年，最多1年。對了，如果不馬上提取蛋白質，最好馬上保存在液氮中(非常方便)，尤其是要做RNA實驗的話，因為只有在液氮的超低溫環境下才能抑制RNase的活性，而RNase又無處不在。
如果是做非變性western，或者研究蛋白質之間的相互作用(比如細胞信號轉導)，比如IP，最好用新鮮的蛋白質，因為反復凍融會嚴重破壞蛋白質和結合蛋白的空間結構。和壹些小分子
並盡可能避免反復凍融。
參考蛋白，如GAPDH和β-肌動蛋白，是相對穩定或修飾的參考蛋白，在細胞中穩定表達。它們和標誌蛋白是相對穩定的蛋白質(或蛋白質片段)，它們的緩沖液中加入了穩定劑(或變性劑)，可以反復凍融(這個要在它們的說明書中說明)。
ERK蛋白，或稱ERK蛋白家族(包括至少5個亞家族)，是壹種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是Ras/Raf/MEK/ERK信號轉導通路的重要成員。如果妳是做信號轉導的，建議妳用新鮮蛋白，避免反復凍融。
至於妳說的marker開啟而目標蛋白沒有，我覺得還是要從妳的實驗本身來分析，因為WB的因素太多了。比如:妳的蛋白質提取成功了嗎？蛋白質樣品是否合格(純度、濃度、提取物等)。)?您的樣品在裝載前是如何處理的(是哪種電泳？哪種膠水？妳使用哪種緩沖劑？需要做飯嗎？需要離心嗎？)?妳的樣本量是多少？妳的目標蛋白的理論濃度是多少或者未知？妳的目標蛋白質的大小是多少？妳的電泳液合適嗎？妳的轉片時間合適嗎？妳的轉印膜電壓或電流合適嗎？妳的轉印膜溫度控制是怎樣的？妳轉完片子後怎麽處理的？您是否使用了合適的密封液？妳選擇的抗體濃度合適嗎？孵化時間夠嗎？洗膜液和洗膜時間是否合適？發光時間夠嗎？等等
建議妳先多了解壹下WB的基本信息，這樣可以多方面分析操作。另外，向有經驗的人多請幾天假對妳會很有幫助。