植物組織丙二醛含量測定
植物葉片在衰老過程中發生壹系列生理生化變化,如核酸和蛋白質含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內源激素平衡失調等.這些指標在壹定程度上反映衰老過程的變化.近來大量研究表明,植物在逆境脅迫或衰老過程中,細胞內活性氧代謝的平衡被破壞而有利於活性氧的積累.活性氧積累的危害之壹是引發或加劇膜脂過氧化作用,造成細胞膜系統的損傷,嚴重時會導致植物細胞死亡.活性氧包括含氧自由基.自由基是具有未配對價電子的原子或原子團.生物體內產生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羥自由基(OH·)、過氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、過氧化氫（H2O2）、單線態氧（O21）等.植物對活性氧產生有酶促和非酶促兩類防禦系統,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶POD和抗壞血酸過氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防禦系統的重要保護酶,抗壞血酸(ASA)和還原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防禦系統中的重要抗氧化劑.
丙二醛(MDA)是細胞膜脂過氧化作用的產物之壹,它的產生還能加劇膜的損傷.因此,丙二醛產生數量的多少能夠代表膜脂過氧化的程度,也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強弱.所以在植物衰老生理和抗性生理研究中,丙二醛含量是壹個常用指標.
[材料、儀器、藥品]
1．材料：植物抗逆性鑒定實驗中的四種菠菜樣品,即綠色和黃色葉片的高溫處理和室溫對照.
2．儀器：(1) 分光光度計；(2) 離心機；（3）水浴鍋：(4) 天平；(5) 研缽；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度離心管；(9) 刻度試管(10ml)；(10) 鑷子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱.
3．藥品：(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液；(2) 石英砂；(3) 5％三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸,先用少量蒸餾水溶解,然後定容到100ml；(4) 0.5％硫代巴比妥酸溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸,用5％三氯乙酸溶解,定容至100ml,即為0.5％硫代巴比妥酸的5％三氯乙酸溶液.
[方法]
1．丙二醛的提取：取0.5g樣品,加入2ml預冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸緩沖液,加入少量石英砂,在經過冰浴的研缽內研磨成勻漿,轉移到5ml刻度離心試管,將研缽用緩沖液洗凈,清洗也移入離心管中,最後用緩沖液定容至5ml.在4500轉/min離心10min.上清液即為丙二醛提取液.
2．丙二醛含量測定：吸取2 ml的提取液於刻度試管中,加入0.5％硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml,於沸水浴上加熱10min,迅速冷卻.於4500轉/min離心10min.取上清液於532、600nm波長下,以蒸餾水為空白調透光率100%,測定吸光度.
3．結果計算：
(A532—A600) ×V1×V
1.55×10-1×W×V2
丙二醛含量（nmol/g）=
式中：A為吸光度；V1為反應液總量(5m1)；V為提取液總量(5ml)；V2為反應液中的提取液數量(2ml)；W為植物樣品重量(0.5g)；1.55×10-1為丙二醛的微摩爾吸光系數（在1升溶液中含有1?mol丙二醛時的吸光度）.
4．註意事項：
(1) 0.0.5％的三氯乙酸對MDA—TBA反應較合適,若高於此濃度,其反應液的非專壹性吸收偏高；
(2) MDA—TBA顯色反應的加熱時間,最好控制沸水浴10~15min之間.時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降；
(3) 如用MDA作為植物衰老指標,首先應檢驗被測試材料提取液是否能與TBA反應形成532nm處的吸收峰.否則只測定532、600nm兩處A值,計算結果與實際情況不符,測得的高A值是壹個假象；
(4) 在有糖類物質幹擾條件下(如深度衰老時),吸光度的增大,不再是由於脂質過氧化產物MDA含量的升高,而是水溶性碳水化合物的增加,由此改變了提取液成分,不能再用532nm、600nm兩處A值計算MDA含量,可測定510、532、560nm處的A值,用A532壹(A510—A560)/2的值來代表丙二醛與TBA反應液的吸光值.