使用 MH 瓊脂，按照商業說明制備，pH 值為 7.2-7.4。對於淋病奈瑟菌，使用含 1%添加劑的 GC 瓊脂基質；對於其他鏈球菌，使用含 5%（V/V）羊血的 MH 瓊脂（檢測磺胺類藥物時，使用裂解的馬血）。.
2.含藥瓊脂平板的制備
根據實驗設計，將不同濃度的抗菌藥物按倍數稀釋後加入已加熱溶解的 MH 瓊脂中，在 45~50 ℃水浴中平衡，混勻後倒入滅菌培養皿中，瓊脂厚度為 3~4 mm。通常采用 1:9 的比例制備藥物瓊脂平板，根據需要選擇藥物的濃度範圍。制備好的藥物瓊脂平板應裝入密封的塑料袋中，在 2~8℃ 的冰箱中保存 5 天。
3.接種物配制與接種
配制濃度相當於 0.5 麥克唐納標準比濁管的菌懸液，再按 1:10 稀釋，用多點接種器吸取配制好的菌液（約 1～2μl ）接種於瓊脂平板表面，每點菌數約為 104CFU，形成直徑為 5～8mm 的菌點。接種後在 35℃培養 16~20h （耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古黴素腸球菌需培養 24h），觀察結果。奈瑟氏菌、鏈球菌在 5%二氧化碳中培養，幽門螺旋桿菌在微氧環境中培養。
4.結果判斷
將平板置於黑暗、不反光的表面，確定試驗終點，以抑制細菌生長的最低藥物濃度作為MIC。在含甲氧芐啶或磺胺瓊脂的平板上見有輕微細菌生長，以抑制細菌生長的最低藥物濃度與生長對照組相比超過80%作為終點濃度。
如果在藥物濃度高於終點濃度的瓊脂平板上生長出 2 個以上的菌落，或在低濃度瓊脂平板上沒有生長而在高濃度瓊脂平板上有生長，則應檢查培養物的純度或重復試驗。