基因轉移
芽孢桿菌和發根農桿菌中的細胞分別含有Ti質粒和Ri質粒,其上有壹段T-DNA。在土壤桿菌通過感染植物傷口進入細胞後,T-DNA可以插入植物基因組。
因此,農桿菌是壹種天然的植物遺傳轉化系統。人們將目的基因插入經過修飾的T-DNA區域,借助農桿菌感染實現外源基因向植物細胞的轉移和整合,然後通過細胞和組織培養技術再生轉基因植物。
農桿菌介導的轉化最初僅用於雙子葉植物。由於技術瓶頸被打破,農桿菌介導的轉化也廣泛應用於單子葉植物,其中水稻被作為模式植物進行研究。
花粉管通道法
授粉後,將含有目的基因的DNA溶液註入子房,利用開花受精過程中形成的花粉管通道,將外源DNA導入受精卵細胞,並進壹步整合到受體細胞的基因組中,隨著受精卵的發育成為具有轉基因的新個體。這種方法是由中國學者周光宇在上世紀80年代初提出的。目前,我國推廣面積最大的轉基因抗蟲棉是通過花粉管通道法培育的。這種方法最大的優點是不依賴組織培養人工再生植株,技術簡單,不需要設備完善的實驗室,常規育種者容易掌握。[14]
細胞核顯微註射
細胞核顯微註射是動物轉基因技術中最常用的方法。它是在顯微鏡下將外源基因註入受精卵的前核,將註入的外源基因與胚胎基因組融合,然後進行體外培養,最後移植到受體雌性動物的子宮內發育,使臨產動物體內的每個細胞都含有新的DNA片段。這種方法的缺點是效率低、位置效應(外源基因插入位點的隨機性)導致的表達結果不確定、動物利用率低,以及反芻動物繁殖周期長、時效性強、需要大量供體和受體的特點。
詳細步驟:在顯微鏡下,用壹根非常細的玻璃針(直徑1-2微米)直接將DNA註射到壹個胚胎的細胞核內,然後將註射了DNA的胚胎移植到動物體內,使其發育成正常的嬰兒。用這種方法生產的動物中,約有十分之壹是整合了外源基因的轉基因動物。
基因槍法
利用火藥爆炸或高壓氣體加速(這種加速裝置稱為基因槍),將包裹有含有目的基因的DNA溶液的高速微子彈直接送入完整的植物組織和細胞中,然後通過細胞和組織培養技術再生植株,選擇轉基因陽性植株作為轉基因植株。與農桿菌轉化相比,基因槍轉化的壹個主要優點是不受受體植物範圍的限制。而且其載體質粒的構建相對簡單,因此也是轉基因研究中廣泛使用的方法。
精子介導法
轉基因技術的圖示
精子介導的基因轉移是使精子經過適當處理後具有攜帶外源基因的能力。然後,攜帶外源基因的精子被用來給發情期的雌性動物授精。雌性動物的後代中,有壹定比例的動物是整合了外源基因的轉基因動物。
與顯微註射相比,精子介導的基因轉移有兩個優點:壹是成本很低,僅為顯微註射的1/10。其次,因為不涉及動物的治療,所以可以用來生產牛或羊進行實驗,以保證每次實驗的成功。
核移植轉基因方法
體細胞核移植是壹種轉基因技術。該方法首先在培養基中培養外源基因和供體細胞,使外源基因整合到供體細胞中;其次,將供體細胞的細胞核移植到受體細胞,即去核的卵母細胞,形成重構胚;第三,將重構胚移植到假孕母鼠體內,懷孕分娩後獲得轉基因克隆動物。
體細胞核移植
首先在體外培養的體細胞中進行基因導入,通過篩選獲得轉基因的細胞。然後,將具有轉基因體細胞核移植到沒有細胞核的卵細胞中,並產生重構的胚胎。重構胚移植到母體後,產生的後代是100%轉基因動物。