熒光偏振法快速準確地高通檢測IgG和含Fc衍生物

熒光偏振法快速、準確和高通檢測IgG和含Fc衍生物。

卡羅琳娜·多爾蒂博士

愛爾蘭都柏林貝萊德福斯特大道尼伯特Valitacell

BMG多功能酶標儀可應用於定量IgG Valita新技術？濃度測定

熒光偏振法直接檢測細胞培養上清液中的IgG

預設酶標儀檢測程序和數據分析模板，提高研究速度

簡介

IgG的準確、快速和高通檢測對於大多數治療性抗體的開發和生產是必不可少的。單克隆抗體在生物制藥領域發揮著重要作用，大量樣本等待進壹步篩選開發。這裏我們介紹壹種全新的直接定量細胞培養上清液中IgG的篩選技術:Valita？效價.

現有的技術，包括蛋白A高效液相色譜(HPLC protein A)、ELISA、蛋白A表面幹涉法和HTRF(Homogeneous Time-resolved Fluorescence)，都有明顯的缺點，包括價格高、人工和耗時。

瓦裏塔？效價法是壹種全新的檢測IgG的方案，準確度高，成本低，檢測範圍為2.5-80 mg/L，Valita？效價使用熒光偏振技術檢測IgG的Fc片段與蛋白G的結合(圖1)。分析在96孔板中進行，具有操作簡單、高通、快速和自動化的特點。該分析可在少量細胞培養基中進行，無需復雜的制備過程。

在本應用指南中，我們介紹壹下在PHERAstar？，POLARstar？歐米茄和CLARIOstar？Valita用在多功能酶標儀上？效價試劑盒定量檢測IgG的方案。

熒光偏振可以有效地分析分子大小的變化。“不動”的熒光基團在偏振光的激發下會發出與激發光偏振方向相同的熒光。但是，與激發光的偏振方向相比，旋轉熒光基團的偏振方向會發生壹定程度的變化。在溶液中，小分子的旋轉速度比大分子快，所以與熒光基團相連的分子大小的變化可以用熒光去極化的程度來衡量。因此，當熒光標記的蛋白G不與其他分子結合時，旋轉更快，去極化更多，而與IgG結合的蛋白G則相反(大5倍)(圖2)。這種偏振變化被用於檢測溶液中的IgG。熒光偏振(FP)通過用平行偏振方向的激發光照射溶液並測量平行方向和垂直方向發射的熒光來實現。FP是兩種偏振熒光之間的歸壹化差值，通常表示為mP。

材料和方法

瓦裏塔？效價測定試劑盒

瓦裏塔？滴定度應用軟件(在套件中提供)

IgG標準(從人血清中獲得的IgG)

PHERAstar、POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶標(BMG實驗室技術公司)

實驗過程

樣品制備應符合試劑盒說明書的相應要求。標準曲線的繪制方法是每個相對熒光值對應壹個IgG標準。在瓦爾塔？加60？l重建緩沖區和60？l標準或樣品。混合後，在黑暗中孵育30分鐘。然後，在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶標儀(BMG LABTECH公司)中，使用預設的檢測程序進行讀數(參數設置見下表)。在火星分析軟件中，獲得的原始數據被轉換成壹個文件。csv格式，然後Valita？用於分析的APP軟件。

儀器設置

結果和討論

圖3中的標準曲線(2.5-80mg/L)是用Valita？在BMG LABTECH公司的具有熒光偏振檢測功能的多功能酶標儀(POLARstar Omega，CLARIOstar，PHERAstar)上。滴定度試劑盒。所有酶標儀器得到的結果都具有很高的穩定性。

最後，我們使用不同條件下培養的樣品和Valita？將滴度定量IgG的結果與常規HPLC的結果進行比較。圖4顯示了兩種方法的結果之間的相關性，表明兩種定量方法都具有良好的準確性，而Valita？滴定度分析速度更快，因為它不需要復雜的樣品制備過程。

結論

在這種生物藥物的開發和生產中，快速測定混合樣品中的IgG濃度是非常重要的。在這裏，我們介紹壹項新技術——Valita？用於基於熒光偏振法快速簡單地測定高通IgG和Fc衍生物。效價分析。瓦裏塔？效價分析法可以直接測定待測樣品中的IgG，無需復雜的樣品制備或純化過程。Valita用的是CLARIOstar，PHERAstar，POLARstar Omega？效價分析顯示了優異的性能。相比其他IgG定量方便，Valita？滴定度具有高通、簡單、準確和快速的特點。