PCR技術在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經滲透到分子生物學領域的各種研究層面。尤其在今年全球大流行疾病中，展現了PCR技術的強大之處。那在科學研究中，我們該如何選擇傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR呢？
首先我們要清楚，三代PCR技術所有的基礎源於PCR反應的基本原理和PCR反應的3個重要階段，分別是指數期、線性期和平臺期。
指數期
指數期內，每個循環PCR產物量大約增加1倍（假定 100%反應效率），該階段的擴增反應具有高度特異性和精確度。
線性期（高變異性）
隨著PCR反應體系成分的消耗，其中的壹個或者多種成分限制反應，導致反應開始減緩，並且每個循環的PCR 產物不再加倍。
平臺期
反應停止，不再產生更多的產物。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每個反應將在不同的時間點進入平臺期，平臺期內可以看到這些差異。
傳統 PCR
傳統PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產物進行分析（圖2），它的局限性就在於只能做定性分析。在圖3中，3個反應孔含有相同量的 DNA模板，但到達平臺期後產生的熒光信號卻不同，說明擴增產物的量存在不同（反應動力學變化所致）。這也表明了傳統PCR平臺期測量時結果存在變異，產出的DNA量不壹定能反映最初情況，所以無法進行定量。
熒光定量 PCR
同樣在圖3中，發現在指數期內，3個反應孔的擴增曲線完全重合，說明指數期內進行檢測將更加精確，可實現更加準確的定量。閾值線是擴增產物熒光強度超過背景時的壹個熒光強度值，樣品達到此熒光強度值所經過的循環數稱為Cq值。通過比較未知濃度的樣品與壹系列標準品的Cq值，可以精確測定未知反應中的模板 DNA數量。
數字 PCR
數字 PCR 是通過將樣本DNA隨機分布至獨立的反應單元中，每個反應單元中包含或者不包含1個或多個拷貝的目標分子，所有獨立的反應單元進行平行擴增後，對每個反應單元的陰性或者陽性熒光信號進行檢測並進行統計學分析，就可以計算出原始樣本的拷貝數，無需參考標準品或內源性對照品，也不需要標準曲線。
傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR的選擇
深藍雲生物科技為您提供美國Azure Cielo 3/6通道熒光定量PCR系統和法國Stilla Naica全自動3色/6色微滴芯片數字PCR系統。
Azure ?Cielo?實時熒光定量PCR系統
來自於美國Azure Biosystems公司，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據實驗需求靈活配置。這款產品采用了高能LED作為光源系統，可保證光源強度高，光源壹致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和幹擾。Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統可為您的科學研究提供高精準度、高靈敏度和高可靠性的實驗結果。
Naica?微滴芯片式數字PCR系統
法國Stilla Technologies Naica數字PCR平臺是實現高靈敏DNA/RNA絕對定量的技術工具，只需壹步移液操作，即可自動生成單層平鋪的微滴，同壹反應液進行多基因的單分子模板擴增，通過三色或六色熒光通道檢測，自動QC質控，識別多色熒光中有效的陰陽性微滴，從而達到目的DNA/RNA的高精準絕對定量。同時提供原始數據、單微滴追溯等功能，確保數據真實可靠。
參考文獻：
1. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 1992;13(3):444-449.
2. Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of ences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.
3. Heyries KA, Tropini C, Vaninsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods. 2011;8(8):649-651.
4. Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013;59(11):1670-1672.
5. Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82.