色譜法根據其分離原理可分為：吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與排阻色譜法等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、矽膠、聚酰胺等有吸附活性的物質。分配色譜是利用被分離物質在兩相中分配系數的不同使組分分離；其中壹相被塗布或鍵合在固體載體上，稱為固定相，另壹相為液體或氣體，稱為流動相；常用的載體有矽膠、矽藻土、矽鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的樹脂有不同強度的陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂，流動相為水或含有機溶劑的緩沖液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔矽膠或玻璃珠等，根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作為流動相。
常用色譜法又可根據分離方法分為：薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。采用薄層色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分；分離無色物質時，可在短波 (254nm) 或長波 (365nm) 紫外光燈下檢視，也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層矽膠，采用熒光猝滅法檢視。氣相色譜法和高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測器檢測。
近年來隨著各種色譜儀器自動化程度的提高，特別是各種聯用技術的發展，使得用現代色譜分析技術進行生藥有效性評價和質量控制變得越來越快速、簡便和靈敏。
（壹）薄層色譜法 (thin layer chromatography, TLC)
薄層色譜法系將供試品溶液點於薄層板上，在展開容器內用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對照物按同法所得的色譜圖對比，並可用薄層掃描儀進行掃描，用於鑒別、檢查或含量測定。《中國藥典》 (2005 年版 ) 壹部薄層色譜法用於定性鑒別的達 1 523 項，用於含量測定的為 45 項，其中有 4 種藥材采用薄層掃描法定量。
1. 操作方法
(1) 薄層板 有市售薄層板（普通或高效板）和自制薄層板，可根據需要選用。
(2) 點樣 通常在潔凈幹燥的環境，用專用毛細管或配合相應的半自動或自動點樣器械將樣品點樣於薄層板上，壹般為圓點狀或窄細的條帶狀，點樣基線距底邊 10 ～ 15mm ，高效板壹般基線距底邊 8 ～ 10mm 。圓點狀直徑壹般不大於 3mm ，高效板壹般不大於 2mm ；接觸點樣時註意勿損傷薄層板表面。條帶狀寬度壹般為 5 ～ l0mm 。高效板條帶寬度壹般為 4 ～ 8mm ，可用專用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣。點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不幹擾為宜，壹般不少於 8mm ，高效板供試品間隔不少於 5mm 。
(3) 展開 將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點 5mm 為宜，密閉。除另有規定外，壹般上行展開 8 ～ 15cm ，高效薄層板上行展開 5 ～ 8cm 。溶劑前沿達到規定的展距，取出薄層板，晾幹，待檢測。
展開前如需要溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，壹般保持 15 ～ 30 分鐘。溶劑蒸氣預平衡後，應迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態，則須在展開缸的內側放置與展開缸內徑同樣大小的濾紙，密閉壹定時間，使達到飽和再如法展開。必要時，可進行二次展開或雙向展開。
(4) 顯色與檢視 供試品含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色或加熱顯色，在日光下檢視。有熒光的物質或遇某些試劑可激發熒光的物質可在 365nm 紫外光燈下觀察熒光色譜。對於可見光下無色，但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的矽膠板 ( 如矽膠 GF 254 板 ) ，在 254nm 紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質形成的色譜。
(5) 記錄 薄層色譜圖像壹般可采用攝像設備拍攝，以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀掃描記錄相應的色譜圖。
2. 系統適用性試驗
用供試品和對照品對實驗條件進行試驗和調整，使檢測靈敏度、分離度和重復性符合要求。
(1) 檢測靈敏度 用於限量檢查時，采用供試品溶液和對照品溶液與稀釋若幹倍的對照品溶液在規定的色譜條件下，於同壹薄層板上點樣、展開、檢視，後者應顯清晰的斑點。
(2) 分離度 用於鑒別時，對照品溶液與供試品溶液中相應的主斑點，應顯示兩個清晰分離的斑點。用於限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度 (R) 的計算公式為：
R ＝ 2(d 2 -d 1 ) ／ (W 1 +W 2 ) 式 (3-5)
式中， d 2 為相鄰兩峰中後壹峰與原點的距離； d 1 為相鄰兩峰中前壹峰與原點的距離； W 1 及 W 2 為相鄰兩峰各自的峰寬。通常分離度應大於 1.0 。
(3) 重復性 同壹供試品溶液在同壹薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標準偏差應不大於 3.0 ％；需顯色後測定的相對標準偏差應不大於 5.0 ％。
3. 測定法
(1) 鑒別 取適宜濃度的對照品溶液與供試品溶液，在同壹薄層板上點樣、展開與檢視，供試品溶液所顯主斑點的顏色 ( 或熒光 ) 和位置應與對照溶液的斑點壹致。
(2) 限度檢查 采用與定量配制的對照品對照或對照品稀釋對照。供試品溶液色譜中待檢查的斑點與相應的對照品溶液或系列對照品溶液的相應斑點比較，顏色 ( 或熒光 ) 不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，峰面積值不得大於對照品的峰面積值。
(3) 含量測定 照薄層色譜掃描法，測定供試品中相應成分的含量。
4. 薄層色譜掃描法
系指用壹定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經激發後能發射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數據用於鑒別、檢查或含量測定。測定時可根據不同薄層掃描儀的結構特點，按照規定方式掃描測定，壹般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。通常含量測定應使用市售薄層板。
掃描方法可采用單波長掃描或雙波長掃描。如采用雙波長掃描，應選用待測斑點無吸收或最小吸收的波長為參比波長，供試品色譜中待測斑點的比移值 (R f 值 ) 和光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜最大吸收與最小吸收應與對照品相符，以保證測定結果的準確性。薄層掃描定量測定應保證供試品斑點的量在線性範圍內，必要時可適當調整供試品溶液的點樣量，供試品與對照品同板點樣、展開、測定和計算。
（二）高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC)
高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。註入的供試品，由流動相帶入柱內，各成分在柱內被分離，並依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。
高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、重現性好、準確度和靈敏度高等優點，其應用範圍之廣，是其它分析儀器所不能比擬的。隨著儀器的普及和蒸發光散射檢測器、質譜檢測器的商品化，本法已成為生藥含量測定的首選和主流方法。《中國藥典》 (2005 年版）壹部應用高效液相色譜法測定含量的中藥品種達 479 種，涉及 518 項，其中藥材就有 98 種 。
1. 對儀器的壹般要求
(1) 色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合矽膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基矽烷鍵合矽膠最為常用，辛基矽烷鍵合矽膠和其他類型的矽烷鍵合矽膠 ( 如氰基矽烷鍵合相和氨基矽烷鍵合相等 ) 也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有矽膠等。離子交換填充劑用於離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用於分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用於對映異構體的拆分分析。
填充劑的性能 ( 如載體的形狀、粒徑、孔徑、比表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等 ) 以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果。孔徑在 15nm(1nm=l0?) 以下的填充劑適合於分析分子量小於 2000 的化合物，分子量大於 2 000 的化合物則應選擇孔徑在 30nm 以上的填充劑。
以矽膠為載體的壹般鍵合固定相填充劑適用 pH2 ～ 8 的流動相。當 pH 大於 8 時，載體矽膠會被溶解；當 pH 小於 2 時，與矽膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用 pH 大於 8 的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純矽膠為載體並具有高表面覆蓋度的鍵合矽膠、包覆聚合物填充劑、有機 - 無機雜化填充劑或非矽膠填充劑等；當需使用 pH 小於 2 的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基矽烷鍵合矽膠、有機 - 無機雜化填充劑等。這些特殊的色譜柱已有商品供應。
(2) 檢測器 最常用的檢測器為紫外檢測器 ( ultraviolet detector, UVD) ，其他常見的檢測器有二極管陣列檢測器 ( diode array detector, DAD) 、熒光檢測器 ( fluorescence detector, FLD) 、示差折光檢測器 ( refractive index detector, RID) 、蒸發光散射檢測器 (evaporative light-scattering detector, ELSD) 、電化學檢測器 (electrochemical detector, ECD) 和質譜檢測器 (mass spectrometrical detector, MSD) 等。
紫外、二極管陣列、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關。示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質量有關。二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物在規定波長範圍內的吸收光譜，故可用於待測物的光譜測定和色譜峰的純度檢查。
紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在壹定範圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常並不呈線性關系，必要時需對響應值進行數學轉換後進行計算。
不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應至少符合紫外 - 可見分光光度法對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，並選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發鹽組分的流動相。
(3) 流動相 可采用固定比例 ( 等度洗脫 ) 或按規定程序改變比例 ( 梯度洗脫 ) 的溶劑組成作為流動相系統。由於 C- 18 鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對於十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低於 5 ％，否則 C 18 鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。
2. 系統適用性試驗
色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等四個指標。其中，分離度和重復性是系統適用性試驗中更具實用意義的參數。
通常用規定的對照品對色譜系統進行系統適用性試驗。
(1) 色譜柱的理論板數 (n) 在規定的色譜條件下，註入供試品溶液或內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間 t R ( 以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位 ) 和半高峰寬 (W h/2 ) ，按 n=5.54(t R ／ W h/2 ) 2 計算色譜柱的理論板數。
(2) 分離度 (R) 無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。分離度的計算公式為：
3) 重復性 取對照品溶液，連續進樣 5 次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大於 2.0 ％。也可配制相當於 80 ％、 100 ％和 120 ％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成 3 種不同濃度的溶液，分別至少進樣 2 次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大於 2.0 ％。
(4) 拖尾因子 (T) 為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合相關規定。
3. 測定法
(1) 內標法加校正因子測定供試品中某個成分含量 精密稱 ( 量 ) 取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照品溶液。取壹定量註入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
校正因子 (f)= 式 (3-8)
式中 As 為內標物質的峰面積或峰高； A R 為對照品的峰面積或峰高； C S 為內標物質溶液的濃度； C R 為對照品溶液的濃度。
再取含有內標物質的供試品溶液，註入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：
含量 (C x ) =f × 式 (3-9)
式中 A x 為供試品峰面積或峰高； C x 為供試品溶液的的濃度； A′ s 為內標物質的峰面積或峰高； C′ s 為內標物質的濃度。 f 為校正因子。
當配制校正因子測定用的對照品溶液和含有內標物質的供試品溶液，使用等量同壹濃度的內標物質溶液時， C s =C′ s ，則配制內標物質溶液不必精密稱 ( 量 ) 取。
(2) 外標法測定供試品中某個成分含量 精密稱 ( 量 ) 取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取壹定量，註入儀器，記錄色譜圖。
由於微量註射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某成分含量時，以定量環或自動進樣器進樣為好。
(3) 面積歸壹化法 是測量色譜圖上某色譜峰和除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算某色譜峰占總面積的百分率。該法通常用於對照品純度的檢查。
高效液相色譜法樣品進樣前的溶液應澄清，通常需經微孔濾膜 (0.45μm) 濾過。
（三）氣相色譜法 (gas chromatography, GC)
氣相色譜法系采用氣體為流動相 ( 載氣 ) 流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先後進入檢測器，用記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。
氣相色譜法對含揮發性成分的生藥應用較廣，精密度高，分離效果比薄層色譜好，但所得數據只有保留時間，多數情況下是在高溫下進行，若成分不氣化，就不能進行分析，故應用範圍受到限制。雖可通過衍生化法或應用特殊色譜柱分析不易揮發的成分，但遠不如高效液相色譜方便、準確。《中國藥典》 (2005 年版 ) 氣相色譜法用於中藥分析的品種有 47 種，其中有 4 種藥材用此法定量。另外還有兩種藥材的農藥殘留也是用 GC 法分析。
1. 對儀器的壹般要求
氣相色譜儀由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態。
(1) 載氣源 氣相色譜法的流動相為氣體，稱為載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供，經過適當的減壓裝置，以壹定的流速經過進樣器和色譜柱；根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣，常用載氣為氮氣。
(2) 進樣部分 進樣方式壹般可采用溶液直接進樣或頂空進樣。
溶液直接進樣采用微量註射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣；采用溶液直接進樣時，進樣口溫度應高於柱溫 30 ～ 50℃ ；進樣量壹般不超過數微升；柱徑越細，進樣量應越少，采用毛細管柱時，壹般應分流以免過載。
頂空進樣適用於固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品制成供試液後置於密閉小瓶中，在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在非氣態和氣態達至平衡後，由進樣器自動吸取壹定體積的頂空氣註入色譜柱中。
(3) 色譜柱 色譜柱為填充柱或毛細管柱。填充柱的材質為不銹鋼或玻璃，內徑為 2~4mm ，柱長為 2~4m ，內裝吸附劑、高分子多孔小球或塗漬固定液的載體，粒徑為 0.25~0.18mm 、 0.18~0.15mm 或 0.15~0.125mm 。常用載體為經酸洗並矽烷化處理的矽藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚矽氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質為玻璃或石英，內壁或載體經塗漬或交聯固定液，內徑壹般為 0.25mm 、 0.32mm 或 0.53mm ，柱長 5~60m ，固定液膜厚 0.1~5.0μm ，常用的固定液有甲基聚矽氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚矽氧烷、聚乙二醇等。
新填充柱和毛細管柱在使用前需老化以除去殘留溶劑及低分子量的聚合物，色譜柱如長期未用，使用前應老化處理，使基線穩定。
(4) 柱溫箱 由於柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性，因此柱溫箱控溫精度應在 ±l℃ ，且溫度波動小於每小時 0.1℃ 。溫度控制系統分為恒溫和程序升溫兩種。
(5) 檢測器 適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器 ( flame ionization detector , FID) 、熱導檢測器 ( thermal conductivity detector, TCD ) 、氮磷檢測器 (nitrogen-phosphorus detector, NPD) 、火焰光度檢測器 ( flame photometric detector , FPD) 、電子捕獲檢測器 ( electron capture detector , ECD) 、質譜檢測器 (mass spectrometric detector, MSD) 等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好，適合檢測大多數的化合物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適於含鹵素的化合物；質譜檢測器能給出供試品某個成分相應的結構信息，可用於結構確證。常用檢測器為火焰離子化檢測器，用氫氣作為燃氣，空氣作為助燃氣，在使用火焰離子化檢測器時，檢測器溫度壹般應高於柱溫，並不得低於 150℃ ，以免水汽凝結，通常為 250 ～ 350℃ 。
(6) 數據處理系統 可分為記錄儀、積分儀以及色譜工作站等。
2. 系統適用性試驗
同高效液相色譜法。
3. 測定法
(1) 內標法加校正因子測定供試品中某成分含量。
(2) 外標法測定供試品中某成分含量。
(3) 面積歸壹化法。
上述 (1)~(3) 法的具體內容均同於高效液相色譜的相應方法。
(4) 標準溶液加入法測定供試品中某成分含量 精密稱 ( 量 ) 取某待測成分對照品適量，配制成適當濃度的對照品溶液，取壹定量，精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定待測成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試液溶液中某待測成分含量。
氣相色譜法定量分析，當采用手工進樣時，由於留針時間和室溫等對進樣量的影響，使進樣量不易精確控制，故最好采用內標法定量；而采用自動進樣器時，由於進樣重復性的提高，在保證進樣誤差的前提下，也可采用外標法定量。當采用頂空進樣技術時，由於供試品和對照品處於不完全相同的基質中，故可采用標準溶液加入法以消除基質效應的影響；當標準溶液加入法與其他定量方法結果不壹致時，應以標準加入法結果為準。
（四）其它色譜分析方法
1. 高效毛細管電泳 (high performance capillary electrophoresis, HPCE)
高效毛細管電泳是壹類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力，在毛細管中按其淌度或分配系數的不同進行高效、快速分離的新型 “ 液相色譜 ” 技術，它是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。它使分析科學得以從微升水平進入納升水平，並使單細胞分析，乃至單分子分析成為了可能，成為生物化學和分析化學中最受矚目的、發展最快的壹種分離分析技術，它在復雜樣品的分離分析中將扮演越來越重要的角色。
2. 毛細管電色譜 (capillary electrochromatography ， CEC ）
毛細管電色譜是綜合了毛細管電泳 (capillary electrophoresis ， CE) 和高效液相色譜 (HPLC) 的優勢而發展起來的新型高效電分離微柱液相色譜技術。 CEC 壹般采用熔融的石英毛細管柱，在柱內填充或管壁鍵合固定相，用高壓直流電源 ( 或外加壹定的壓力）代替高壓泵，產生電滲流 (electroosmotic flow ， EOF) 代替壓力驅動流動相，溶質依據它們在流動相與固定相中的分配系數的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，因而既能分離中性物質又能分離帶電組分。
近年來高效毛細管電泳和毛細管電色譜在生藥化學成分的分析中有許多嘗試，取得顯著進展。