關鍵詞:缺氧；中藥合劑；抗氧化劑；谷胱甘肽過氧化物酶；過氧化氫酶
中藥合劑對缺氧大鼠腦的抗氧化保護作用
喬峰、蔣、*、李霞、、潘、建、元
(南通大學，江蘇省226001，中國；南京醫科大學附屬淮安醫院，淮安223000。上海交通大學海洋工程科學研究所，上海200231，中國)
目的觀察中藥合劑對大鼠腦缺氧的影響。方法在低壓艙中建立缺氧狀態。研究了中藥合劑對缺氧和常氧狀態下大鼠腦組織中谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性的影響。在另壹個實驗中，用茜素紫分光光度法在體外測定上述混合物的羥自由基清除活性。結果低氧組GSH含量和GSHPX、CAT活性均顯著下降，但中藥合劑預處理組GSH和GSHPX下降幅度較小。在常氧狀態下，中藥合劑使GSH和GSH-PX升高。此外，在體外H2O2/ Co2+實驗體系中，中藥合劑對羥自由基的清除作用呈劑量依賴性。結論本研究結果提示中藥合劑對缺氧大鼠腦具有抗氧化神經保護作用，其機制可能與提高抗氧化酶GSHPX活性和GSH含量，以及直接清除自由基有關。
關鍵詞缺氧；中草藥混合物；抗氧化；GSH-PX；加泰羅尼亞語
近年來，實驗研究表明，神經保護是防治缺氧性腦損傷的有效措施，尤其是抗氧化藥物的開發和應用已成為防治神經元損傷的熱點之壹。國內外研發的許多西藥神經保護劑都有壹定的毒副作用，因此臨床應用受到限制[1]。我國對中藥抗缺氧作用的研究表明，中藥具有作用溫和、保護作用壹致、神經細胞損傷多樣的特點，但目前研究僅限於單壹藥物，復方制劑的抗氧化和自由基清除能力報道較少。對丹參、當歸、黨參、黃芪等中藥的研究表明，它們都具有提高耐缺氧能力、清除氧自由基、降低血液粘度、改善微循環等多種功能[2，3]。利用已建立的低壓缺氧模型，觀察上述藥物組成的混合物對缺氧性腦損傷的抗氧化保護作用及其體內外抗自由基能力，並分析其可能機制，為臨床應用提供實驗依據。
1材料和方法
SD大鼠40只，材料為1.1，其中24只由南通大學實驗動物中心提供，體重(240±20)g，分為常氧組(5只雄性，4只雌性)、低氧組(8只雄性，半只雌性)和中藥合劑組(4只雄性，3只雌性)。65，438±06只動物，體重(230±20)g，購自上海復旦大學實驗動物科學系。分為對照組和中藥合劑組，每組8只，雌雄各半。中藥合劑由上海交通大學海洋水下工程科學研究所提供。主要成分為丹參、當歸、黨參、黃芪，生藥含量為0.4 g/ml。GSH、GSHPX和CAT試劑盒購自南京程健生物工程研究所。茜素紫(C20H12O7)由Chroma公司生產，上海化學試劑站分裝廠分裝。其他試劑均為國產AR級。
1.2方法
1.2.1的給藥方法實驗前(缺氧)48、24、1 h對所有中藥合劑組進行腹腔註射(i.p .)，劑量為1 ml/200 g？wt .另兩組註射等量的生理鹽水。
1.2.2缺氧暴露:將中藥合劑組和缺氧組動物置於低壓艙(艙容為0.01 m3)，關閉艙門，調節艙壓，在1 h內分三個階段將壓力降至相當於海拔8 040 m的氣壓(0 ~ 3 130 ~ 6 080 ~ 8。中間兩階段分別停留在10和15 min，保持8 040 m壓力5 h，然後加壓出艙10 min。常氧組作為實驗對照，在常壓下在艙側停留6 h。
1.2.3樣品制備中藥合劑組和缺氧組在出艙後與常氧組動物壹起快速斷頭。取左側腦組織，在0 ~ 4℃冷生理鹽水中沖洗，去除血液，用濾紙擦幹，稱重(約100 ~ 130 mg)，加入9倍的0 ~ 4℃生理鹽水。對照組和中藥合劑組動物腦勻漿的制備在末次給藥後65±48小時進行。
1.3檢測指標GSH、GSHPX、CAT的測定均按試劑盒說明書分步進行。福林酚法測定腦勻漿中蛋白質含量。采用改良的茜素紫分光光度法檢測H2O2/Co2+體系產生的羥自由基，測定中藥合劑對羥自由基的清除率[4]。在測定過程中，根據參考文獻[5]中每種藥物的濃度制備三個平行樣品，並計算平均值。
1.4處理的腦勻漿中GSH、GSHPX、CAT的結果用(s)表示，數據用Stata6.0統計軟件進行統計處理，用單因素方差分析和Scheffe法進行比較。羥自由基清除率數據用非線性回歸的四參數Logistic標準曲線模擬，EC50按下式計算:y = min+(max-min)/(1+(x/EC50)hill slope)。
2個結果
2.1中藥合劑對缺氧處理後腦勻漿中GSH、GSH-PX、CAT的影響見表1。
表1中藥合劑對缺氧處理後大鼠腦組織GSH、GSH-PX和CAT的影響(略)
與常氧組相比，δP < 0.01；與缺氧組相比，* P < 0.05#P<0.01
表1表明，缺氧暴露後，大鼠腦中GSH含量、GSH-PX和CAT活性明顯降低(P < 0.05438+0)。中藥混合物預先使用後再暴露於缺氧環境，三項指標均上升。與缺氧組相比，GSH和GSH-PX的變化有統計學意義(P < 0.05或P < 0.01)，但與常氧組相比仍明顯下降(P < 0.01)。結果表明，該中藥合劑具有壹定的抗氧化和神經保護作用。
2.2中藥合劑對常氧狀態下腦勻漿中GSH、GSH-PX和CAT的影響見表2。
表2中藥合劑對常氧狀態下腦組織中GSH、GSH-PX和CAT的影響(略)
與生理鹽水組相比，* P < 0.05，* * P < 0.01；n=8
表2顯示，與生理鹽水組相比，中藥合劑組GSH、GSH-PX、CAT均升高，僅GSH、GSH-PX變化有統計學意義(P < 0.05或P < 0.01)。說明在常氧條件下，中藥合劑能提高腦組織的GSH水平和GSH-PX活性，增強腦組織的抗氧化能力。
2.3中藥合劑體外抗羥自由基作用見圖1。如圖1所示，中藥合劑體外清除率與藥物濃度之間存在明顯的量效關系，即濃度越大清除效果越好，但達到壹定濃度後趨於飽和。根據計算，中藥合劑的濃度(EC50)為0.07 ml/10 ml，相當於2.8 mg/ml。
圖1羥自由基清除率與藥物濃度的量效關系(略)
3討論
研究表明，缺氧性腦損傷是壹個復雜的病理生理過程，涉及神經遞質系統功能障礙、細胞內鈣超載、神經毒性以及壹氧化氮和自由基的炎癥損傷等多種機制。自由基的急劇增加是缺氧的重要病理生理基礎[6]。正常情況下，人體內的自由基是不斷產生和清除的。大腦缺氧時，體內氧化-氧化系統失衡，形成惡性循環，導致體內自由基堆積。自由基清除和抗氧化制劑可分為酶自由基清除劑和非酶自由基清除劑。酶促自由基清除劑主要有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)。本文研究結果表明，缺氧導致腦組織勻漿中GSH-PX、CAT活性和GSH含量降低，表明腦組織抗氧化系統的抗氧化能力降低，而中藥合劑能明顯減輕缺氧時GSH含量和GSH-PX活性的降低，提高腦組織的抗氧化能力，有助於減輕腦缺氧損傷。通過進壹步的實驗，我們發現中藥合劑在正常情況下也能提高腦組織中GSH-PX活性和GSH含量。此外，體外抗羥自由基實驗表明，該中藥合劑對羥自由基也有直接清除作用，且有劑量依賴關系。這些結果表明，如果將中藥混合物用於腦缺氧，具有抗缺氧的神經保護作用，這可能與配方中的藥物提高了體內抗氧化酶的活性和自身對氧自由基的清除作用有關。谷胱甘肽具有重要的生理功能。可通過GSH-PX減少體內不斷產生的脂質過氧化物和過氧化氫，以消除其對酶和膜蛋白上巰基的氧化作用，維持細胞和組織的正常功能和代謝[7]。反應中生成的GSSG可被GSH還原酶催化，磷酸戊糖旁路生成的還原型輔酶ⅱ(NADPH)在缺氧時可被還原回GSH。由於過氧化物生成速率大大超過細胞內NADPH生成速率，GSH/GSSG比值降低，GSH-PX活性降低，導致氧化應激。GSH-PX是大腦中含量較高的含硒酶，在與超氧化物歧化酶(SOD)共處理自由基的過程中起主要作用。可以清除線粒體和細胞質中產生的H2O2，從而預防。哦)。羥基自由基在化學性質上非常活躍，被認為是對生物體危害最大的自由基[9]。它具有與自由基清除劑和組織反應的強能力，因此非常高濃度的自由基清除劑可以是有效的。事實上，當自由基清除劑濃度很高時，往往會產生明顯的副作用，限制了很多藥物的應用[10]，而中藥優勢很大，作用溫和，環節多，相互之間可能存在協同作用。綜上所述，在本實驗條件下，中藥合劑對大鼠缺氧腦組織具有壹定的抗氧化神經保護作用，這與藥物提高機體自身抗氧化能力及其對自由基的直接清除作用有關。本研究為該中藥合劑在抗缺氧性腦損傷中的應用提供了重要參考。
參考資料:
〔1〕肖漢恩，趙，巴伯帕，等.實驗性缺血在臨床中風醫學中的應用〔J〕。Curr Opin Neurol，2003，16(1): 65。
[2]溫宏斌，張君健。中醫藥對缺氧性腦損傷保護作用及其機制的研究進展[J].現代中西醫結合雜誌，2003，12(10):11114。
[3]張，李霞。丹參與缺血再灌註損傷的研究進展[J].山西醫科大學學報，2003，17 (5): 182。
馮曉，泛金庸，姜正林。“茜素紫分光光度法測定H2O2/Co2+產生的羥自由基”壹文自由基清除率計算公式芻議[J]。化學試劑，2005，27(5):301，304。
熊，，譚達峰，等.三種大黃不同部位提取物體外清除羥自由基的實驗研究[J].食品科學，2003，24(1):128。
〔6〕 Rauca C，Zerbe R，Jantze H，等.羥自由基在缺氧預處理中的重要性〔J〕大腦研究，2000，868(1): 14。
蔡愛玲，康愛華。谷胱甘肽血紅蛋白與氧化應激[J].外國醫學？臨床生物化學與檢驗科學，2002，23 (3): 147。
〔8〕克·PJ，泰勒·JM，德·漢JB等.谷胱甘肽過氧化物酶-1在超氧化物歧化酶-1轉基因小鼠對缺血/再灌註損傷的神經保護作用中的作用〔J〕腦血流代謝雜誌，2003，23(1): 19。
〔9〕 Halliwell B .自由基和抗氧化劑:個人觀點〔J〕。Nutr Rev，1994，52(8): 253。
〔10〕孔托斯哈。腦缺血中的氧自由基:2001 Willis講座〔J〕斯托克，2001，32(11): 2712。
基金項目:江蘇省高校自然科學基金2003年度資助項目(03KJD310185)。
(南通大學，江蘇南通226001；南京醫科大學附屬淮安第壹醫院，江蘇淮安223000；上海交通大學海洋水下工程研究所，上海200231)