維生素C的不同測定方法
目前關於維生素C測定方法的報道很多，如熒光法、2,6-二氯靛酚滴定法、2,4-二硝基苯肼法、光度分析法、化學發光法、電化學分析法、色譜法等，各種方法對實際樣品的測定都是有效的。對實際樣品的測定結果令人滿意。
為了了解國內VC含量測定方法的現狀和發展及其應用情況，我們將以下方法應用於樣品中VC含量的測定。
為了解國內VC含量測定及其應用的現狀和發展，我們檢索了中國期刊網（CNKI）1994-2002年科技A、B、醫藥類全文數據庫，從年代、作者地區、刊物級別、樣品類型、測定方法等方面對VC含量測定的文獻數據進行了分析。結果顯示，核心期刊的文獻占了相當大的比例。核心期刊的成果占文獻總數的 45.06%，其中光度法占 65.69%，電化學法占 18.63%，色譜法占 12.75%；復雜樣品的文獻占文獻總數的 45.06%，其中光度法占 60.92%，色譜法占 19.54%，電化學法占 10.34%。結論目前，我國維生素C含量的測定仍以光度法為主，但近年來色譜法尤其是高效液相色譜法的上升趨勢尤為明顯。
I.熒光法
1.原理
樣品中還原型抗壞血酸經活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸後，與鄰苯二胺（OPDA）反應生成具有熒光的喹喔啉，熒光強度與壹定條件下脫氫型抗壞血酸的濃度成正比，可用於食品中抗壞血酸和脫氫型抗壞血酸總量的測定。
脫氫抗壞血酸是食品中最重要的成分。
脫氫抗壞血酸與硼酸可形成絡合物，不與 OPDA 發生反應，從而消除了樣品中熒光雜質的幹擾。該方法的最低檢出限為 0.022 g/ml。
2.適用範圍
該方法適用於蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定。
3.註意事項
3.1 多數植物組織中含有壹種破壞抗壞血酸的氧化酶，因此測定抗壞血酸應使用新鮮樣品，並盡快用偏磷酸-乙酸分析樣品。
3.2 有些果膠含量高的樣品不易過濾，可采用過濾的方法，也可先離心，取上清液過濾。
3.3 活性炭能將抗壞血酸氧化成脫氫抗壞血酸，但它也有吸附抗壞血酸的作用，所以活性炭的用量要適當、準確，要用天平稱量。實驗結果證明，2g 活性炭能使所測樣品中的還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫抗壞血酸，其吸附作用不明顯。
二、2,6-二氯靛酚滴定（還原型VC）
1、原理：
還原型抗壞血酸可還原染料2,6-二氯靛酚，2,6-二氯靛酚在酸中呈紅色，被還原後紅色消失。還原型抗壞血酸可還原 2,6-二氯靛酚，而 2,6-二氯靛酚本身又會被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質幹擾的情況下，壹定量的樣品提取物還原出的標準 2,6-二氯靛酚的量與樣品中維生素 C 的含量成正比。此法用於還原型抗壞血酸的測定，總抗壞血酸的測定常用 2,4-二硝基苯肼法和熒光分光光度法。
2.註意事項
（1）所有試劑最好用再蒸餾水配制；
（2）滴定時，可同時吸取兩個樣品。
(3)樣品進入實驗室後，應浸泡在已知量的 2% 草酸溶液中，以防止氧化和維生素 C 的損失；
(4)儲存時間過長的罐頭食品可能含有大量的低鐵離子（Fe2+），應使用 8% 的醋酸而不是 2% 的草酸。此時若用草酸，低鐵離子可還原2,6-二氯靛酚，使測定數升高，可避免使用醋酸；
（5）整個操作過程要迅速，避免還原抗壞血酸被氧化；
（6）在處理各種樣品時，如泡沫產生，可加幾滴辛醇消除；
（7）測定樣品溶液時，需做空白對照，測定樣品溶液時，需做空白對照。需做空白對照時，用樣品溶液滴定體積減去空白體積。
3優點：具有簡便、快速、準確等優點，適用於多種不同類型的樣品分析。缺點是不能直接測定樣品中脫氫抗壞血酸和結合抗壞血酸的含量，且易受其他還原性物質的幹擾。如果樣品中含有色素物質，會給滴定終點的觀察帶來困難。在酸性環境中，抗壞血酸（還原型）會將染料 2,6-DCIP 還原成無色的還原型 2,6-DCIP，而抗壞血酸則會被氧化成脫氫抗壞血酸。氧化後的 2,6-DCIP 在中性或堿性溶液中呈藍色，而在酸性溶液中呈粉紅色。因此，當用 2,6-DICP 滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時，在所有抗壞血酸被氧化之前，滴入的 2,6-DCIP 會立即還原成無色、壹旦溶液中的所有抗壞血酸都被氧化，滴入極少量過量的 2,6-DCIP 就會立即使溶液呈現淡粉色或淡紅色，這是滴定的終點，表明溶液中的所有抗壞血酸都剛剛被氧化。根據滴定過程中消耗的 2,6-DCIP 標準溶液量（毫升），可以計算出樣品中的抗壞血酸含量。氧化的 2,6-DCIP 和還原的抗壞血酸之間的反應通常在稀草酸或偏磷酸溶液中進行。也就是說，先將樣品溶解在壹定濃度的酸性溶液中或提取後，再用 2,6-DCIP 標準溶液滴定到終點。
食品和生物材料中通常含有其他還原性物質，其中壹些會使 2,6-DCIP 還原脫色。為了消除這些還原性物質對定量測定的幹擾，可以先用抗壞血酸氧化酶處理樣品，破壞樣品中的還原型抗壞血酸，然後再用 2,6-DCIP 滴定樣品中的其他還原性物質。然後從滴定非抗壞血酸還原性物質所消耗的 2,6-DCIP 標準溶液總量中減去滴定抗壞血酸實際消耗的 2,6-DCIP 標準溶液量。這樣就可以計算出樣品中的抗壞血酸含量。此外，還可以利用抗壞血酸和其他還原性物質與 2,6-DCIP 反應速度的差異，將樣品溶液的 pH 值控制在 1 - 3 之間，進行快速滴定，這樣可以消除或減少其他還原性物質的影響，壹般在這種條件下，幹擾物質與 2,6-DCIP 的反應速度較慢或受到抑制。生物液體（如血液、尿液等）中抗壞血酸的測定較為困難，因為這些樣品中的抗壞血酸含量較低，存在許多幹擾還原性物質，而且必須事先進行脫蛋白處理。生物液體中存在巰基、亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽物質，它們都會與 DCIP 發生反應，但反應速度比抗壞血酸慢得多。在定量測定的樣品中加入對氯巰基苯甲酸（簡稱 PCMB）通常可以消除巰基物質的幹擾。
三、2,4-二硝基苯肼法
1.原理
總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮戊二酸。樣品中的還原型抗壞血酸經活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸，再與 2,4-二硝基苯肼作用生成紅色嗪，嗪的含量與總抗壞血酸的含量成正比，用比色法測定。
2.適用範圍
本方法適用於蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定。
這是壹種嗪比色法，因其目前作為測定Vc的國家標準方法之壹而單獨評價，屬於總測定法，與原苯肼法原理相似。首先，樣品中的還原型 V 被氧化成脫氫型 V，然後與 2,4-二硝基苯肼作用生成紅色澤因，將其溶於硫酸後進行比色測定。最近，國家標準中強調了空白，每個樣品和標準系列都需要做相應的空白，以消除不同顏色和背景帶來的誤差。在實際西梅汁Vc測定中，操作時間較長，操作要求較嚴格，試劑較多，就壹般實驗室而言是可以采用現行方法的。
四碘法
1、維生素C的原理
維生素C包括氧化型、還原型和二酮糖酸三種。用碘滴定維生素 C 時，被滴定的碘被維生素 C 還原成碘化物。由於維生素 C 在滴定過程中被完全氧化，滴定的碘將以碘分子的形式存在。碘分子可以使含有指示劑（澱粉）的溶液產生藍色，這就是滴定的終點。
2、註意事項
（1）看到紅棕色出現，滴定速度減慢。
（2）藍色在滴定終點 30 秒內不褪去。
左旋抗壞血酸（維生素 C）測定試劑盒（酶法）
1.適用於食品、飲料和生物制品檢測
2. 比色法
本方法適用於檢測水果和蔬菜（如馬鈴薯）、水果和蔬菜制品（如番茄醬、腌菜、果醬、果汁）、嬰兒食品、啤酒、飲料...液體、粉末和焙烤食品、肉制品、乳制品、葡萄酒以及動物飼料、藥品（如維生素制劑、解熱鎮痛藥）和生物樣本中的左旋抗壞血酸（維生素 C）
3. 分析物
左旋抗壞血酸在動物和植物中的含量各不相同。人類自身無法產生 L-抗壞血酸，因此必須從外源性來源（維生素 C）中獲取。由於技術原因，L-抗壞血酸通常從水果和蔬菜中提取，在食品工業中被用作抗氧化劑。左旋抗壞血酸是壹種相對靈敏的物質，檢測左旋抗壞血酸非常適合對來自未加工水果和蔬菜的加工食品進行質量評估。
L-抗壞血酸可作為維生素產品和副作用藥物等藥品生產中的壹種成分，此外還可用於動物飼料添加劑。
4.原理
L-抗壞血酸（x-H2）+MTT+ PMS->脫氫抗壞血酸（x）+MTT-甲臢+H+X
L-抗壞血酸+?O2 AAO-> 脫氧抗壞血酸 + H2OX
5.特異性
在給定的條件下，這種方法特別適用於 L-抗壞血酸。合成的 D-阿拉伯糖基抗壞血酸/阿拉伯糖型抗壞血酸可作為抗氧化劑，也會發生反應，但速度較慢。
6.靈敏度
在 1.600 毫升的樣品量中，檢測靈敏度為 0.005 個吸光度單位，相當於 0.1 毫克/升的樣品溶液中 L-抗壞血酸的濃度。如果吸光度相差 0.015 個單位，則檢測限為 0.3 毫克/升，樣品量最大為 1.600 毫升。
7.線性
檢測的線性範圍從 0.5 微克/升-抗壞血酸（0.3 毫克/升-抗壞血酸/升樣品溶液體積 1.600 毫升）到 20 微克/升-抗壞血酸（0.2 gL-ascorbic acid/l sample solution volume of 0.100 ml.）。
8.精確度
在用壹個樣品重復實驗的情況下，重復實驗可能會產生 0.005-0.010 個吸光度單位的差異。標準品的相對偏差（變異系數）約為 1-3%。在分析檢測數據時，應考慮到 L-抗壞血酸水溶液的穩定性較差，尤其是在重金屬離子或氧氣存在的情況下。
9.幹擾和誤差來源
谷物中的成分很少幹擾實驗。高濃度的酒精和 D-山梨醇會降低反應速度。必須加入甲醛才能除去大量亞硫酸鹽。金屬離子和亞硫酸鹽離子會導致 L-抗壞血酸自發分解。
10.試劑盒包括的內容
1.磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液 ---- pH 約 3.5；MTT
2.AAO（抗壞血酸氧化酶）--每板約 17 U AAO
3.PMS 溶液
VI.用磷鉬藍分光光度法測定維生素 C
根據維生素 C 在壹定反應條件下可被磷鉬酸錠定量還原成磷鉬藍這壹事實，提出了壹種測定維生素 C 的新的分光光度法。該方法簡便、快速，適用於生物、藥物和其他樣品中維生素 C 的測定，具有良好的準確度和重復性。
1適用範圍
本標準適用於水果、蔬菜及其加工品（不含二價鐵、二價錫、壹價銅、二氧化硫、亞硫酸鹽或硫代硫酸鹽）中還原型抗壞血酸的測定，不適用於深色樣品。
2測定原理
染料2,6-二氯靛酚的顯色反應有兩個特點，壹是取決於其氧化還原狀態，氧化態為深藍色，還原態變為無色；二是受其介質酸堿性的影響，在堿性溶液中為深藍色，在酸性介質中為淺紅色。
將藍色堿性染料標準溶液、含維生素 C 的酸性浸出液進行氧化還原滴定，染料被還原成無色，當滴定終點時，酸性介質中多余的染料顯示為淺紅色，由染料的量計算出樣品中還原抗壞血酸的量。
VII.二甲苯-二氯靛酚比色法
1 適用範圍
深色樣品中還原型抗壞血酸的測定。
2測定原理
采用定量的2,6-二氯靛酚染料與樣品中的維生素C進行氧化還原反應，過量染料在酸性環境中呈現紅色，經二甲苯萃取後比色，吸光度與染料濃度在壹定範圍內呈線性相關，收集剩余染料濃度，用差減法計算維生素C的含量。
VIII.近紅外漫反射光譜法（NIRDRSA）
自 1965 年首次應用於復雜農產品樣品的分析以來，近紅外漫反射光譜法以其樣品處理簡單、分析速度快等優點逐漸受到分析界的重視。該方法已廣泛應用於石油、紡織、農業、食品和藥物分析等領域 [1，2]。在藥物分析中，NIRDRSA 可用於定性鑒定和定量分析。
維生素 C 是壹種不穩定的二烯醇化合物，《藥典》中采用碘量法測定其含量[3]。我們采用近紅外漫反射光譜法（NIR-DRS）直接測定維生素 C，該方法簡單可靠，無需對樣品進行預處理。
這是因為近紅外光譜區的光頻與有機分子的C-H、O-H和N-H振動的合頻和倍頻重合，因此可以通過有機化合物的近紅外光譜獲得C-H、O-H和N-H的特征振動。由於近紅外光譜的帶寬較寬，且光譜重疊嚴重，無法用特征峰等簡單方法進行分析，需要借助計算機技術和化學計量學方法。本實驗采用偏最小二乘法（PLS）[4]，首先利用標定集建立預測模型，然後將預測集作為未知樣品，根據預測模型進行預測。
對於選定的光譜範圍，采用 MSC（散射校正）對反射吸光度進行預處理，並對 25 個樣品進行交叉驗證，即選取壹個樣品，從定標集中刪除該樣品對應的光譜和濃度數據，並將光譜主成分分數設為 1，循環叠代樣品數和主成分分數，計算預測結果的殘差平方和，從而確定所需的主成分分數。如果主成分太小，會丟失樣本信息，太大又會造成過度擬合。當主因子為 2 時，預測殘差平方和最小，為 2.029。因此，選擇主因子數為 2，建立最佳 PLS 修正數學模型。
9 電位滴定法
1.原理：根據滴定過程中電池電動勢的變化確定反應終點。
鉑為指示電極，甘汞為參比電極
E電池=E+-E-+E液勢=EI2/I-+k（常數）
2.原理（具體：）
隨著滴定劑的加入，由於化學反應的發生，待測離子的濃度會不斷變化，從而指示電極的電勢也會相應變化，導致電池電勢相應變化，測量點也會相應變化。電勢隨之變化，測量點附近的離子濃度會突然變化，導致電勢突然變化，因此可以通過測量工作電池的電勢變化來確定終點。
3.計算公式：(與碘量法相同）Wvc=C(I2)V(I2)M(vc)/m(vc ) *100%
4. 優點：
解決了滴定分析中遇到五顏六色或渾濁溶液時無法指示終點的問題
用線性電位滴定法分析抗壞血酸，抗壞血酸的回收率在 99.80%~101.5% 之間。線性電位滴定法分析維生素C片中抗壞血酸的回收率為99.80%～101.5%，相對標準偏差為0.61%，線性電位滴定法分析維生素C片中抗壞血酸的回收率為98.90%～100.5%，相對標準偏差不大於0.48%，說明線性電位滴定法分析維生素C片中抗壞血酸含量是可行的。
X .分光光度法
1.原理：
維生素C在空氣中，特別是在堿性介質中極易被氧化成脫氫抗壞血酸，pH>5時，脫氫抗壞血酸內環裂解，形成二酮古洛糖酸。脫氫抗壞血酸、二酮古洛糖酸和 2,4-二硝基苯肼可生成硫酸可溶性鋅
鋅在 500nm 波長處有最大吸收
根據樣品溶液的吸光度，由工作曲線求出 VC 的濃度，即可求出 VC 的含量
十壹庫侖滴定法
1.原理庫侖滴定法屬於恒流庫侖分析法。
它是在特定的電解質中，以電極反應生成物為滴定劑（電生滴定劑，相當於化學滴定中的標準濃溶液）和待定量測定的物質，借助指示劑或電位測定滴定終點。
2.基本依據--法拉第電解定律：電解時，電極體上發生化學反應的物質的質量與通過電解池的電量Q成正比
即：m = MQ/zF = MI t /zF
3.化學反應：陰極反應：2H+2e-=H2 陽極反應：2I-=I2+2e-
4． 終點指示：多種方法
（1）化學指示劑--I2
（2）恒電位法
（3）雙鉑電極電流指示法
5．計算公式Wvc = MvcQ/zFm 式中：F---法拉第常數（96487C）
Z---電極反應中轉移的電子數 註：使電解效率達到 100%
6.優點：
1）無需標準化試劑溶液，省去了大量標準物質的配制（制備、校準）
2）只需優質電源、定時器、小型鉑電極，且易於自動化控制
3）若電流保持恒定值，可大大縮短電解時間
4）功率大小易於控制，測量準確；
5）滴定劑來自電解的電極產物，可以進行容量分析不易實現的滴定。容量分析法不易實現的滴定過程，如 Cu+、Br2、Cl2 與待測物反應後立即產生。 註意：電流效率＝i 樣品÷i 總＝i 樣品÷（i 樣品＋i 電容＋i 雜質）
因為：實際電解過程中還有影響電流效率的因素，如，雜質．因為在實際電解過程中，還有影響電流效率的因素，如，雜質、溶劑、電極本身對電極的反應等。
十二紫外快速測定法
原理
維生素C 2,6-二氯苯酚靛酚容量法，操作過程較為繁瑣，且受其他還原性物質的影響較大，樣品顏色顏料顏色與測定時間有關。紫外快速測定法，是根據維生素 C 具有紫外吸收和堿不穩定性的特點，在 243nm 處測定樣品溶液與堿處理後的樣品溶液兩者消光值的差值，通過核對標準曲線，即可計算出樣品中維生素 C 的含量。
光電比濁法的十三條原理
原理
在酸性介質中，抗壞血酸和亞硒酸（H2SeO3）可以定量地進行氧化還原反應。1 摩爾抗壞血酸可被 2 摩爾亞硒酸還原成硒。在壹定條件下，生成的元素硒會在溶液中形成穩定的懸浮液。當抗壞血酸的濃度在 0-4 毫克/25-50 毫升範圍內時，溶液的渾濁度與抗壞血酸的含量成正比。在分光光度計上測量試液的濁度，即可定量測定抗壞血酸。
十四熒光分析原理
原理
抗壞血酸經酸洗活性炭氧化成順式脫氫抗壞血酸，然後與鄰苯二胺縮合形成熒光化合物。在氧化後的樣品中加入硼酸，可使脫氫抗壞血酸與鄰苯二胺形成硼酸脫氫抗壞血酸絡合物，而硼酸脫氫抗壞血酸絡合物不會與鄰苯二胺產生熒光化合物，從而檢測樣品中其他熒光雜質的幹擾。這樣，就可以測出其他熒光雜質的空白熒光強度並進行校正
十五原子吸收間接法
原理
這是最近報道的壹種測定 Vc 的方法，其原理是還原的 Vc 在酸性介質中能定量地將 Cu2+ 還原成 Cu+，並與 SCN- 反應生成 CuSCN 沈澱，在高速離心下沈澱。沈澱後，在高速離心機下有效分離沈澱，仔細洗滌後用濃硝酸溶解，用原子吸收法測定銅含量，即可推斷出樣品中維生素 C 的含量。該方法的實驗儀器比較昂貴，主要問題是操作過程中反應完全與否，沈澱洗滌、離心反復多次，很容易帶來誤差。這種方法的優點是不受果蔬本身顏色的幹擾，具有壹定的發展前景。根據試驗發現，這種方法的效果較低，還有待進壹步優化和改進。
十六、金納米顆粒分光光度法金納米顆粒分光光度法測定維生素C
本發明公開了壹種金納米顆粒分光光度法測定維生素C的方法。在5 mL比色管中依次加入0.1-2.0 mL濃度為95.64 μg/mL的HAuCl↓[4]溶液、0.02-0.50 mL濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，再加入0.001-2.38mg/mL的維生素C溶液，混勻後，加入二次蒸餾水至體積，再充分混勻，在分光光度計上，於520nm處測定吸收值，同時進行空白試驗。本發明的測定方法簡單快捷，所用儀器價格低廉，試劑易得
十七種L-半胱氨酸修飾電極用於維生素C的測定
研究了L-半胱氨酸修飾電極的制備方法及其電化學行為，並將其用於維生素C的測定。在 pH=10.0 的 NH4Cl- NH3-H2O 緩沖溶液中，VC 在 L-半胱氨酸修飾電極上產生了靈敏的氧化峰，峰電流與 VC 濃度在 1.0×10-3~1.0×10-6 mol/L 範圍內呈良好的線性關系，相關系數為 0.9962，其最低檢測限可高達 1.0×10-6 mol/L，與紫外光譜法的結果壹致。
測定維生素 C 的方法有多種，包括使用 I2 或二氯靛酚（DPI）進行氧化還原滴定。壹般來說，滴定法是壹種快速、簡單、準確的技術，它通過滴定劑和被滴定物質之間的等價反應來準確測定被測物質的含量。DPI 對維生素 C 具有良好的選擇性，是壹種理想的氧化劑。
十八 梅特勒-托利多儀器方法
傳統的滴定方法是手動滴定，根據指示劑顏色的變化來確定終點，通過測量滴定劑的消耗量來計算待測物質的含量。手動滴定法有許多缺點：手動控制誤差大，計算復雜，不同反應需要特殊的指示劑。梅特勒-托利多的自動電位滴定儀解決了這壹問題，它通過測量滴定反應過程中的電位變化來確定終點，全自動操作和計算，測量快速，結果準確。梅特勒-托利多的滴定儀配備了存儲卡軟件包，存儲了成熟的滴定方法，便於快速解決實際應用問題，並可將其作為實驗方法，稍加修改即可進行新的測定。
此外，還有雙光束殘留染料差減比色法、2_6_二氯靛酚鈉動力學分光光度法、聚中性紅修飾電極法、示波測定溴量法等、流動註射化學發光抑制法、磷鉬鎢雜多酸作發色劑快速檢測法、溶解氧測定裝置測定果蔬抗壞血酸含量法等。在此不再壹壹介紹。