孫德輝1，2，蔡1*，常慧雲1，杜1。
(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疾病病原生物學國家重點實驗室，家畜病毒學農業部重點開放實驗室，甘肅蘭州730046；2.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州730070)
摘要:RNA幹擾(RNAi)是壹種由雙鏈RNA介導的基因沈默現象。RNAi主要發生在細胞核外，具有操作簡單快速的特點。RNAi被發現至今已有10多年，期間研究重點從機理研究轉向應用研究。本文從RNAi的起源、可能的作用機制和特點出發，重點介紹了RNAi的應用。
關鍵詞:RNA幹擾；雙鏈RNA基因沈默
RNAi是Napoli C D等人[1]在試圖將色素合成基因轉入紫色矮牽牛花以增加其顏色時發現的。令人意想不到的是，轉基因植株不僅不能表達新的基因，而且其色素合成也減弱了，壹些轉基因花朵出現了全白或部分白。他們將這種現象命名為導入的基因不表達，植物本身合成的色素基因失活(共抑制)。(粗糙脈孢菌)？當合成胡蘿蔔素的基因被導入後，會導致基因失活，這就是所謂的基因靜止。郭等[2]發現正義RNA和反義RNA具有相同水平的抑制作用，但未能對此現象給出合理的解釋。Fire A等[3]在反義核苷酸的研究中發現，雙鏈RNA( double stranded RNA，DsRNA)能有效抑制具有互補序列的內源基因，抑制效果優於單鏈反義RNA。至此，雙鏈RNA誘導RNAi的概念正式提出，拉開了RNAi研究的序幕。
1 RNAi的可能機制和特征
1.1 RNAi的作用機制
雖然RNAi的確切機制尚不清楚，但壹般認為是Bass假說，可歸納為三個階段。
(1)初始階段。在細胞中，雙鏈RNA(dsRNA)被核酸酶III (RNase III) Dicer加工成21 ~ 23個堿基的小RNA，即小幹擾RNA(small interfering RNA，SiRNA)。siRNA是雙鏈結構，有19 ~ 21個堿基對，其3’端有兩個遊離的不成對核苷酸。發現siRNA是RNAi的重要中間分子，其序列與靶mRNA高度同源。雙鏈兩端有2 ~ 3個突出的未配對3’堿基；兩個單鏈末端分別是5’-末端的磷酸根和3’-末端的羥基，這是細胞區別真正的siRNA和其他雙鏈RNA的結構基礎。研究表明，沒有5’-末端磷酸基團的平端siRNA或siRNA不具有RNAi的功能[4]。
(2)在起始階段，siRNA與Argonaute蛋白家族和其他未知因子結合，形成siRNA-核糖核蛋白復合物(SIRNP)。在ATP和其他未知因素的參與下，雙鏈siRNA解卷形成RNA誘導沈默復合物(RISC)。RISC可能以完全單鏈或雙鏈解旋但不完全分離的形式存在，然後RISC在dsRNA的介導下與互補mRNA結合並降解。mRNA在轉錄後水平降解，抑制基因表達。所以它也被稱為轉錄後基因沈默(PTGS)。
(3)循環擴增階段。在siRNA誘導RNAi的過程中，可能還存在壹個siRNA的循環擴增過程，以維持其RNA誘導功能。推測這壹過程是以siRNA為引物，互補mRNA為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶(RDRP)作用下合成新的雙鏈RNA，然後Dicer作用產生新的siRNA，完成siRNA的擴增過程。
關於RNAi機制中重要酶作用的研究，Zamore P D等[6]發現21 nt RNA指導mRNA的降解；Scharf W D等[7]發現依賴ATP的RNA解旋酶是Mut6Grishok A等[8]發現Let-7和lin-4是內源性RNAi基因(stRNA)；Dalmay T等[9]提出依賴RNA的RNA聚合酶是SDE-1；Bernstein E等[10]證實了RNaseш-like核酸酶是dicerElbashir S M等[11]應用外源21 nt-siRNA抑制同源mRNA的表達；Novina C D等【12】證實，無論是針對病毒感染細胞所需的CD4受體，還是針對病毒基因組的gag區域，siRNA都能有效沈默病毒和細胞的基因，抑制HIV的感染和復制。
1.2 RNAi的特征
(1)"***抑制"。RNAi是雙鏈RNA介導的轉錄後基因沈默機制，其啟動子相當活躍。外源基因可以轉錄，但mRNA不能正常積累。RNAi不僅在轉錄後水平滅活外源基因，而且誘導同源內源基因沈默。
(2)效率高。實驗表明，雙鏈RNA幹擾mRNA翻譯的效率比單純的反義或正義RNA高幾個數量級。RNAi可以在比反義核酸低幾個數量級的濃度下將靶基因的表達降低到非常低的水平，甚至完全“敲除”，導致缺失突變表型。比基因敲除技術更方便，科學家稱RNAi技術為目標基因或目標蛋白的“敲除”。
(3)特異性高。被dsRNA降解的小幹擾RNA，除了其正義鏈3’端的兩個堿基外，都是序列識別所必需的。單個堿基的改變可以使RNAi失效，RNAi可以特異性降解mRNA，帶有同源基因* * *序列的RNAi可以使所有同源基因失活。
(4)穿透力強。RNAi具有很強的穿透性，可以在不同細胞之間遠距離傳遞和維持，如在含有雙鏈RNA的溶液中餵養表達雙鏈RNA的細菌，將雙鏈RNA導入香等。
(5)“遺傳”。已經觀察到RNAi的作用通過線蟲中的生殖系傳遞給後代，表明RNAi在壹定程度上是可遺傳的。
(6)穩定性高。可能存在壹種自然機制來穩定細胞中的siRNA。這種機制可能是siRNA與保護性蛋白結合，從而使其相對穩定。這些雙鏈RNA不需要像反義核酸壹樣進行許多化學修飾來提高其半衰期。
(7)雙重幹涉系統。哺乳動物的非特異性幹擾和特異性幹擾有兩種獨立的方式。非特異性幹擾反應由30個堿基對以上的雙鏈RNA介導，導致整個細胞內非特異性蛋白質合成和RNA降解受到抑制。特異性反應由21 BP ~ 25 BP的小幹擾RNA介導，可以逃避非特異性幹擾系統的“監控”，只降解其序列對應的單個基因的mRNA[11]。
2研究方法
在研究過程中，研究者們逐漸探索並總結出壹套完整的研究方法。目前，進行RNAi操作主要有兩種方法。壹種是直接轉染約21堿基長度的siRNA靶向特異性基因或45-50堿基長度的RNA(小發夾RNA，shRNA)進入細胞。ShRNA會在細胞內自動加工成siRNA，導致基因沈默或表達抑制。二是構建特異性siRNA表達載體，通過質粒在體內表達siRNA，導致基因沈默。這種方法的優點是消除了RNase的幹擾，延長了siRNA的半衰期。更重要的是，這種方法可以篩選穩定表達的細胞系，並隨著質粒復制擴散到全身。這種基因抑制效應可以代代相傳。實驗表明，可被化學合成或體外合成抑制的基因也可被表達相同序列的載體表達的siRNA抑制。
3 RNAi的應用
3.1基因的功能研究
在神經生物學研究中，科學家通過siRNA表達質粒有效抑制了腹側中腦神經元多巴胺能相關基因，並通過病毒介導的RNAi建立了此類成年小鼠模型，不僅為建立神經系統功能缺失模型找到了壹些有價值的表型標記，對神經系統的基因治療也有壹定的參考意義；在癌癥研究中，通過shRNA表達載體成功抑制了成年大鼠腦癌基因，對RNAi(穿越血腦屏障)的遠程基因沈默方法進行了非常有益的探索。利用雕亡途徑，通過RNAi抑制雕亡基因Caspase-8可以提高急性肝衰竭小鼠的存活率，並且發現Caspase-8 siRNA治療對特異性Fas激活劑(Jo2和AdFasL)和野生型腺病毒介導的急性肝衰竭均有效，表明該動物模型可以反映人類急性病毒性肝炎的多分子參與機制。使用siRNA治療急性肝炎患者的希望增加了。除了壹些關鍵基因的RNAi研究外，在哺乳動物細胞中也探索出了基因組水平的siRNA篩選方法。他們建立了壹系列包含8000多個基因的siRNA表達框架文庫，通過這些文庫，高通可以篩選出NF-kB信號通路中已知的和獨特的基因。RNA幹擾作為篩選數百甚至數千個基因的工具，也在發揮著越來越重要的作用[13]。RNAi提供了壹種快速而相對簡單的方法來系統地抑制RNA分子合成蛋白質。通過抑制壹個基因的RNA信號壹段時間，研究人員可以深入研究基因功能，進而描述從細胞形態到信號系統占主導地位的遺傳網絡。
3.2基因治療和藥物篩選的探索
由於RNAi針對的是轉錄後階段的基因沈默，與傳統的基因治療相比，整個流程設計更簡單、更快速、更有效，為基因治療開辟了新的途徑。總體思路是通過加強關鍵基因的RNAi機制，控制疾病中異常的蛋白質合成過程或外源致病核酸的復制表達，特別是對人類健康造成嚴重危害的病毒。比如2003年全球多個國家和地區流行的SARS，就是由具有單鏈核酸的新型冠狀病毒引起的。尋找藥物靶點和設計核酸藥物更加方便。目前很多公司都在積極研發這方面的藥物。比如美國俄勒岡州的AVI生物制藥公司，在SARS藥物的研究上壹鳴驚人，國內很多研究機構和生物技術公司也投入了這項工作。比如上海生命科學院就成立了SARS防控的研究團隊，其中生化細胞研究所和醫學研究所的壹些研究小組正在從RNAi的角度努力工作。此外，北京大學、中南大學、北京動物研究所等高校和研究機構，以及北京金賽仕反義核酸技術發展有限公司也開展了RNAi藥物。
基因治療最引人註目的進展之壹是對肝炎病毒RNAi的研究。Mccaffrey A P等人成功地在細胞水平上抑制了HBV的復制，並且在轉染HBV質粒後免疫活性缺乏的小鼠的肝臟中抑制了復制。與對照組相比，小鼠血清中檢測到的HBsAg下降了84.5%。免疫組化分析HBcAg下降率達99%以上。哈佛大學的利伯曼研究小組通過註射抗Fas的siRNA過度激活炎癥反應，然後將Fas超驅動的抗體註射到試驗小鼠體內，發現未經siRNA治療的對照組小鼠在幾天內死於急性肝功能衰竭。然而，用siRNA治療的小鼠有82%存活，其中80%~90%的肝細胞與siRNA結合。而且RNAi起作用10 d，3周後完全下降。因為Fas很少在肝細胞以外的其他細胞中高水平表達，所以對其他器官幾乎沒有副作用。此外，該團隊和其他研究人員積極開展了艾滋病毒的RNAi測試。目前有報道稱，他們針對CCR5蛋白的siRNA可以阻止HIV進入免疫細胞約3周，還可以阻止感染病毒在感染細胞內的復制。
不過，雖然已經取得了不少研究成果，但真正用於醫療還需要壹段時間。目前大部分還處於小鼠試驗階段，siRNA的引入多為靜脈或腹腔註射、尾部註射、細胞移植等。如何有效地給人用藥，既保證藥效在靶器官組織的有效釋放，又具有高安全性，需要進壹步研究。人們期待RNAi引領的新醫學革命的到來。
在藥物篩選領域，除了線蟲RNAi的高通定量藥物篩選模型，Lavery K S等人高度評價了RNAi在藥物篩選領域的應用前景，RNAi技術將逐漸成為藥物靶標篩選和識別的有力工具。他對如何在藥物篩選的各個階段應用RNAi做了具體的描述和展望，並指出將該技術與高通定量篩選、體外生物檢測和體內疾病模型相結合，將在藥物開發過程中提供大量關於基因功能的有用信息。
3.3抗腫瘤治療
多種癌基因可作為靶標設計相應的siRNA[14]。Brummelkamp T R等[15]用逆轉錄病毒載體將siRNA導入腫瘤細胞，癌基因K2RAS (V12)的表達被特異性抑制。急性髓系白血病的研究取得了良好的成果。Scherr M等[16]以引起慢性髓系白血病和bcr2abl陽性急性淋巴細胞白血病的bcr2abl癌基因為靶基因，設計了相應的siRNA。達到了87%的有效抑制率。Wilda M等[17]也成功用siRNA抑制了白血病BCR/ABL融合基因的表達。因此，基於RNAi技術的抗腫瘤藥物的開發具有巨大的潛力。據悉，壹種全新的生物工程藥物“RNA幹擾劑”(非幹擾素)已經浮出水面，預計三年內上市。科學家經過多年探索，終於發現癌細胞和病毒RNA的22個堿基對中，有1個堿基對是專門負責復制的。只要能讓這些堿基對休眠，癌細胞或病毒就會自動停止復制。這壹重要發現為壹種全新的藥物——RNA幹擾劑奠定了基礎。科學家認為，艾滋病、乙肝、惡性膠質瘤(惡性腦瘤)和胰腺癌有望成為RNA幹擾劑的首批受益者(RNA幹擾劑的臨床試驗已於2004年獲得FDA批準開始)，艾滋病、多發性硬化癥、阿爾茨海默病和帕金森病等中樞神經系統退行性疾病將成為第二批受益者。
3.4抗病毒治療
由於RNAi是體內壹種古老而天然的抗病毒機制，目前國外科技人員針對HIV gag、tat、rev、nef等基因，針對丙肝病毒非結構蛋白5B基因，針對脊髓灰質炎病毒衣殼蛋白和聚合酶基因，針對口蹄疫病毒3D片段設計了siRNA[18]。他們都在實驗中取得了理想的結果。已有關於RNAi抑制細胞內其他病毒復制的報道，如呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒[19]等。在中國，還設計了針對口蹄疫病毒VP1基因的siRNA和針對丙型肝炎病毒5’保守區的siRNA。針對口蹄疫病毒IRES和L串聯序列兩側保守區的siRNA[20]和針對SARS冠狀病毒的6個siRNA，即RL001、RL002、RL003、RL004、RL005和RL006，都取得了理想的效果。針對病原體的siRNA已經進行了動物實驗[21]，針對病毒性疾病的siRNA。
3.5轉基因研究
基因沈默經常發生在動物和植物的轉基因實驗中。因此，探索基因沈默的機制可以為轉基因研究中避免基因沈默提供對策。在轉基因植物研究中避免基因沈默可以提高實驗的成功率，節省時間，而在大規模動物轉基因研究中避免基因沈默可以節約成本，提高生產率。
3.6幹細胞研究
在幹細胞研究中，在dsRNA阻斷大鼠骨髓源性神經幹細胞Hes5表達的實驗中[22]，觀察到外源短dsRNA在轉錄後mRNA水平降低基因表達的效率，並對影響因素進行了初步探討。同時，由於幹細胞可能有自己的壹套基因組，不同類型的幹細胞有自己獨特的基因，這些基因可能是決定幹細胞特性的最關鍵的實質性因素。因此，RNAi技術在該領域具有廣闊的應用空間。
3.7研究信號傳導的新方法
生物技術認為，結合傳統的缺失突變技術和RNAi技術，很容易確定復雜信號轉導通路中不同基因的上下遊關系。Clemensy等人利用RNAi研究了果蠅細胞系中的胰島素信號轉導通路，得到了與已知胰島素信號轉導通路相同的結果。與傳統轉染實驗相比，RNAi技術更簡單、快速、重復性好，克服了轉染實驗中重組蛋白特異性聚集和轉染率低的缺點。因此，認為RNAi技術有可能成為研究細胞信號轉導通路的新途徑。
3.8常見疾病的治療
《自然》雜誌報道了miRNA(微小RNA)應用的壹項重要發現。miRNA的成功利用調節胰島素分泌，為糖尿病的治療帶來了新的希望，也將為糖尿病新藥的研究帶來新的曙光和思路。Sicence雜誌稱，表明RNAi技術的應用可以有效降低血管中的膽固醇含量，對心血管疾病的治療效果明顯。
4展望
綜上所述，RNAi技術在基因功能研究、抗腫瘤治療、抗病毒治療、基因應用研究、常見疾病治療等諸多方面都是強有力的工具和手段。同時，作為壹種新興的生物技術，仍有廣闊的研究和應用空間供研究者探索。例如，siRNA在持續病毒感染過程中扮演什麽角色？siRNA在冬眠動物中扮演什麽角色？RNAi在雀斑的形成中起什麽作用？如果解決了上述問題，有望根據其機制和特點應用於持續性病毒感染的鑒別診斷和治療，利用冬眠動物siRNA的作用進行星際航行，解決能量供應和時間轉換問題，應用RNAi祛斑。
盡管對RNAi的研究已經取得了許多突破，特別是在哺乳動物細胞中，但由於RNAi的機制尚未完全闡明，仍有許多問題沒有得到完全解答。例如，siRNA在哺乳動物細胞中抑制mRNA表達是有效的，但它不能達到果蠅細胞那樣高的抑制率，可能是因為生物進化水平越高，調控基因表達系統的復雜性越高，多種抑制機制之間的相互作用頻率越高，影響抑制的因素越多。此外，RNAi能否成功抑制哺乳動物的基因表達，抑制的程度也取決於細胞類型。對於線蟲來說，可以通過註射、浸泡或餵食的方式將其轉化為dsRNA，而對於哺乳動物來說，尋找壹種高效的轉移siRNA的方法和快速篩選siRNA的方法仍在進壹步探索中。RNAi在抗病毒感染方面的應用令人鼓舞，但要取得最終的成功還有很長的路要走。其中壹個關鍵原因是siRNA不能作用於所有的病毒RNA，壹些病毒靶序列可能隱藏在二級結構下或位於高度折疊區域。然而，壹些病毒序列可能與蛋白質形成緊密的復合物，這阻礙了與siRNA的識別。因此，不僅要選擇合適的靶序列，還要進行反復實驗。另壹個重要原因是病毒後代的突變率很高，這使得病毒逃脫了siRNA的識別。為了克服這壹障礙，所選病毒RNA的靶序列必須高度保守，或者設計數必須同時作用於siRNA[23]。
總之，RNAi作為壹種新發展起來的分子生物學技術，必然會存在潛在的問題，這就需要研究人員在使用這項技術時考慮生物安全性等諸多問題，從而使RNAi技術更好地服務於人類。
參考文獻(略)