1.稱量
按培養基配方比例依次準確稱取牛肉膏、蛋白腖、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放入小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解後倒入燒杯中。也可將其放在稱重紙上，稱重後直接放入水中，這時如果稍加加熱，牛肉膏就會與稱重紙分離，然後立即將稱重紙取下。蛋白腖極易吸潮，應迅速稱量。另外，稱量藥品時要防止混藥，壹個角勺稱量壹種藥品，或稱量壹種藥品後，洗凈、晾幹，再稱量另壹種藥品，瓶蓋也不能搞錯。
2.溶解
在上述燒杯中，可先加入少於規定量的水，用玻璃棒攪拌，然後，放在石棉網上加熱溶解。待藥物完全溶解後，再補充水至所需的總體積。若配制固體培養基，則將稱量好的瓊脂放入溶解好的藥物中，然後加熱溶解，在瓊脂溶解過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊燒杯底破裂。最後補足失去的水分。
3.調節 pH 值
調節 pH 值前，先用精密的 pH 試紙測量培養基的原始 pH 值，如果 pH 值偏酸，則用滴管向培養基中逐滴加入 1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，並隨時用 pH 試紙測量 pH 值，直到 pH 值達到 7.6。相反，可使用 1mol/L HCl 進行調節。註意 pH 值不要調得過高，以免回調，否則會影響培養基中各離子的濃度。
4.過濾
趁熱用濾紙或多層紗布過濾，便於觀察結果。壹般無特殊要求，可省略此步驟（本實驗不需要過濾）。
5.分裝
根據實驗要求，可將配制好的培養基分裝到試管或三角燒瓶中。分裝裝置如圖五-1所示。
分裝過程中，註意不要使培養基沾在試管口或瓶口上，以免沾汙棉塞，造成汙染。
（1）液體分裝時分裝高度以試管高度的 1/4 左右為宜。
（2）固體分裝分裝試管時，裝量不超過試管高度的1/5，滅菌後做成斜面。三角燒瓶分裝以分裝量不超過三角燒瓶容積的壹半為宜。
（3）半固體分裝試管壹般以試管高度的1/3為宜，滅菌後垂直冷凝。
6.加塞
培養基分裝後，用棉塞塞住試管或三角燒瓶口，防止外界微生物進入培養基造成汙染，並保證有良好的通氣性能。
7.包紮
塞好棉塞後，用麻繩將所有試管捆紮好，再在棉塞上包壹層牛皮紙，防止滅菌時棉塞被冷凝水打濕，然後在棉塞外面再捆紮壹根麻繩。用記號筆標明培養基名稱、組別、日期。帶塞子的三角燒瓶，外面用牛皮紙包好，用麻繩打成活結狀，使用時便於解開，同樣用記號筆標明培養基名稱、組別、日期。
8.滅菌
上述培養基應在 1.05kg/cm2（15 磅/平方英寸）、121.3℃下高壓滅菌 20 分鐘。如遇特殊情況不能及時滅菌，應放入冰箱保存。
9.擱置斜面
滅菌後的試管培養基冷卻至50℃左右，將試管棉塞的壹端擱置在玻璃棒上，擱置斜面的長度以不超過試管總長度的壹半為宜。
10.無菌檢查
將滅菌後的培養基放入37℃溫室中培養24-48小時，以檢查滅菌是否完全。
簡要步驟
在燒杯中加入100毫升水，放入牛肉膏、蛋白腖和氯化鈉，用蠟筆在燒杯外壁做上記號，然後放在火上加熱。燒杯中的成分溶解後，在不斷攪拌下加入瓊脂，以免粘底。待瓊脂完全溶解後補足損失的水分，用 10%鹽酸或 10%氫氧化鈉調節 pH 至 7.2~7.6，分裝到各個試管中，加入棉塞，用高壓滅菌器滅菌：每平方厘米 1.05 千克，121 攝氏度維持 15 ~ 30 分鐘。
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