壹、簡述
臭氧有很高的能量，很不穩定，在常溫，常壓下，臭氧結構易變，很快自行分解為氧和單個氧原子。後者具有極強的氧化作用，臭氧的半衰期為22~25min。生成臭氧的原料主要是空氣和電能。臭氧殺菌機制：（1）作用於細胞膜，導致細胞膜的通透性增加，細胞內物質外流，使細胞失去活動；（2）使細胞活動必需的酶失去活性；（3）破壞細胞內的遺傳物質或使其失去功能。臭氧殺滅病毒是通過直接破壞核糖核酸或脫氧核酸完成的。而殺滅細菌、黴菌類微生物則是臭氧首先作用與細胞膜，使細胞膜的構成收到損傷，導致新陳代謝障礙並抑制其生長，臭氧繼續滲透破壞膜內組織，直到死亡。不同潔凈室可根據其體積，選用適當的臭氧發生器，將主機設置在 HVAC系統的送、回風主管道中或凈化空調箱的中效過濾器後端的合適位置，電源控制系統置於機房內。消毒時，關閉新風進口（或關閉約90%的新風進口閥門）和回風對外排放閥門，是整個被消毒的潔凈室空氣通過凈化系統風道形成內循環狀態。每天開機1~1.5h進行空氣滅菌；替代化學藥劑熏蒸消毒及設備表面滅菌需開機2~2.5h。10萬級別的潔凈區，臭氧投加濃度為10MG/M3。臭氧衰減率為0.375。按空間的大小投加量計算：臭氧發生器產量=體積*10/0.375按這計算出來的臭氧發生器產量，基本的能達到10萬級別潔凈區的潔凈標準。
二、目的
制劑的生產過程主要在潔凈區完成，潔凈區用臭氧滅菌的效果直接影響到產品的質量，為確認臭氧滅菌的可靠性,用臭氧滅菌取代甲醛熏蒸滅菌，減少對員工身體健康的損害，特制訂本驗證方案進行驗證。驗證過程應嚴格按照本方案規定的內容進行,若因特殊原因確需變更時,應填寫驗證方案變更申請及批準書,報驗證小組批準。
三、工藝原理圖
將臭氧氣體引到送風主管道中，利用HVAC系統中凈化風機產生的壓力風源，擴散至所控制的整個潔凈區域。
四、驗證計劃
(1)、潔凈區空氣消毒方法原理：
1.1 是采用臭氧發生器產生臭氧後，通過 HVAC 系統機組的正壓送風段和送風管送入潔凈區，再通過回風管回到機組，組成壹個閉合的空氣循環系統，控制消毒過程中的循環時間或密閉時間，從而使壹定濃度的臭氧氣體在規定的時間內，殺滅潔凈區內的微生物。
1.2 為了保證消毒效果，應確保空氣消毒時，HVAC 系統運行或消毒劑氣體循環時，外界新鮮空氣不得進入 HVAC 系統內，以防止消毒劑氣體濃度下降，達不到規定的消毒濃度。
(2)、空氣滅菌機理及特點：
2.1 臭氧滅菌機理及特點：
2.1.1 臭氧在常溫、常壓下分子結構不穩定，很快自行分解成氧和單個氧原子，後者具有很強的活性，對細菌有極強的氧化作用，可氧化分解細菌內部氧化葡萄所必需的酶，從而破壞其細胞膜，將它殺死。多余的氧原子則會自行重新結合成為普遍氧分子，不存在任何有害殘留物，故稱無汙染消毒劑；
2.1.2 臭氧是壹種廣譜殺菌劑，可殺滅細菌繁殖體和芽孢、病毒、真菌等，並可破壞肉毒桿菌毒素。但其具有腐蝕性，臭氧為強氧化劑,可損壞多種物品,濃度越高對物品損害越重，故在利用臭氧消毒時，應對潔凈區內容易被氧化或加速老化的物品（如塑料、橡膠）、產品等進行防護。
2.1.3 臭氧熏蒸消毒時，相對濕度高則效果好，低則效果差，對幹燥菌體幾乎無殺菌作用。
2.1.4 空氣中臭氧濃度達0.01-0.02mg/L 時即可嗅知，濃度達到 1mg/L 時，可引起呼吸加速、變、胸悶等癥狀，在2.5-5mg/L 時，可引起脈搏加速，疲倦、頭痛，停留1小時可發生肺氣腫，以至死亡，故臭氧消毒時，嚴禁潔凈區內具有人員在操作。
2.1.5 臭氧穩定性極差，常溫下即可自行分解為氧，臭氧發生器停止發生後，HVAC 系統繼續運行通風30－60分鐘，使臭氧完全分解後，人員才可進入潔凈區進行操作。
2.1.6《消毒技術規範》中規定，對空氣中浮遊菌，臭氧滅菌濃度為 2-4PPM，對物體表面的沈降菌，臭氧的滅菌濃度為 10-15PPM，臭氧 1H 的的衰退率約為 62.25%。應根據等消毒的空間體積（V）、要求殺滅微生物的濃度（C）和臭氧 1H 的的衰退率確定臭氧發生器的發生量。公式為：W（臭氧發生量）=（CV）/（1-62.25%）mg/h。
(3)、消毒頻率：
3.1 10萬級潔凈區內的空氣消毒，必須在下列情況下進行:
3.1.1 每天消毒：潔凈室和 HVAC 系統日常消毒只采用臭氧消毒進行，目的是消滅空氣中的浮遊菌；
3.1.2 每月定期消毒：潔凈室和 HVAC 系統每月消毒采用甲醛和臭氧交替使用，防止產生耐藥菌株，目的是消滅環境中浮遊菌和沈降菌；
3.1.3 環境監控：當潔凈區內環境微生物檢測結果超標時，按每月定期消毒執行；
3.1.4 停產：潔凈區內停產壹周以上，生產前按每月定期消毒壹次。
（4）、消毒設備及消毒劑：
4.1 酒精燈，36%的甲醛溶液；
4.2 臭氧發生器、臭氧；
（5）、消毒方法：
5.1 消毒前準備工作：
5.1.1 潔凈室內應進行了全面的衛生清潔工作，包括廠房、設備、容器、清潔工具等；
5.1.2 潔凈室內應無中間體、半成品、原輔料的暴露存放及無操作人員；
5.1.3 用潔凈抹布醮純化水擦拭設備、墻壁的外表面，用潔凈拖把醮飲用水擦抹地面，保持潔凈區濕潤；
5.1.4 關閉車間內所有強排風口，打開潔凈區內傳遞窗內側門；
5.1.5 關閉 HVAC 系統的新風口閥和全開總回風閥門。
5.1.6 臭氧和甲醛消毒前的準備工作相同，但利用甲醛時，應對與產品直接接觸的設備、容器等內表面進行防護，以防止甲醛集合附著在其表面，而臭氧可不必考慮。
5.2 臭氧消毒方法：
5.2.1 HVAC 系統正常運行後,接通臭氧發生器電源，電源指示燈亮，電壓表顯示電壓為220V；
5.3.1 將臭氧發生器按紐旋至“手動”位時,啟動臭氧發生器(A、B)消毒按紐，電流表顯示工作電流 3.6A，同時指示燈亮，臭氧發生器開始工作，記錄開始消毒時間；
5.3.2 消毒時間：臭氧每天消毒時間為 1－1.5 小時（消滅空氣中的浮遊菌），每月定期消毒時間為 2－2.5 小時（消滅環境中浮遊菌和沈降菌）。
5.3.3 日常消毒或每月定期消毒在規定消毒時間結束後，關閉臭氧發生器啟動按紐，關閉總電源，臭氧發生器停止工作。
5.3.4 臭氧消毒結束後，潔凈區內需人員進行操作時，HVAC 系統應繼續運行 30min,再打開工藝排風機和新風閥補充新風，機組繼續運行 30min 後，使潔凈區內臭氧完全分解後，人員方可進入潔凈區。
5.3.5 臭氧消毒結束後，潔凈區內如不需人員進行操作（如當天生產結束後消毒），可直接關閉 HVAC 系統風機，第二天 HVAC 系統運行達到自凈時間（40min）後，人員可直接進入潔凈區操作。
五、驗證方案
5.1 日常臭氧滅菌
5.1.1滅菌周期：3天。
5.1.2 滅菌時間
5.1.2.1 1小時
5.1.2.2 1.5小時
5.1.2.3 2小時
5.1.3 滅菌後檢測(每個時間連續做三個周期的檢測)
5.1.3.1 檢查指標
5.1.3.1.1 檢測沈降菌
5.1.3.1.2生物指示劑進行細菌挑戰性試驗，生物指示劑菌種選用枯草芽孢桿菌，在使用測定前要測定其初期菌數，應不少於10個。在消毒滅菌前，將裝有生物指示劑表面皿置於被測房間內的中央地面，滅菌前打開表皿，滅菌結束後，回收生物指示劑放入硫乙醇酸鹽液體培養基中，在37℃下培養3天。
5.1.3.2 認可標準:
5.1.3.2.1 沈降菌：100級，沈降菌≤1個/皿、1萬級，沈降菌≤3個/皿、10萬級，沈降菌≤10個/皿
5.1.3.2.2 生物指示劑：應無菌生長
5.1.4 沈降菌、生物指示劑檢測記錄見驗證實施報告
5.2 大消毒
5.2.1滅菌周期：半個月。
5.2.2 滅菌時間
5.2.2.1 2小時
5.2.2.2 2.5小時
5.2.2.3 3小時
5.2.3 滅菌後檢測(每個時間連續做三個周期的檢測)
5.2.3.1 檢查指標
5.2.3.1.1 檢測沈降菌
5.2.3.1.2生物指示劑進行細菌挑戰性試驗
生物指示劑菌種選用枯草芽孢桿菌，在使用測定前要測定其初期菌數，應不少於10個。在消毒滅菌前，將裝有生物指示劑表面皿置於被測房間內的中央地面，滅菌前打開表皿，滅菌結束後，回收生物指示劑放入硫乙醇酸鹽液體培養基中，在37℃下培養3天
5.2.3.2 認可標準:
5.2.3.2.1 沈降菌：100級，沈降菌≤1個/皿、1萬級，沈降菌≤3個/皿、10萬級，沈降菌≤10個/皿
5.2.3.2.2 生物指示劑：應無菌生長
5.2.4 沈降菌、生物指示劑檢測記錄見驗證實施報告
5.3 擬訂再驗證方案周期：
當滅菌時間、滅菌設備發生變化，或是沈降菌定期監控的數據有負面趨勢的情況下，應按照前期驗證采用的方法對臭氧滅菌進行再驗證，或根據實際情況修補驗證方案後進行再驗證，以確認滅菌效果。
5.4 驗證結果總評定：
5.4.1 質保部負責收集各項驗證，試驗結果報驗證小組。驗證小組負責對驗證結果進行評審，做出驗證結論，發放證書，並對驗證結果進行評審填入“驗證結果完整性總評價記錄表” ,其內容包括：
5.4.1.1 驗證結果是否有遺漏?
5.4.1.2 驗證實施過程中對驗證方案有無修改,修改原因、依據、是否經過批準？
5.4.1.3 驗證記錄是否完整？
5.4.1.4 試驗驗證結果是否符合標準要求?偏差及對偏差的說明是否合理?是否需要進壹步補充試驗?
5.4.1.5 偏差及對偏差的說明是否合理?是否需要進壹步補充試驗?
5.4.2 驗證結果總評價與會簽:
5.4.2.1總評價：
5.4.2.2會簽
6驗證方案評價及最終批準：
6.1驗證方案評價：
6.2驗證方案最終批準：
六、驗證原始記錄
沈降菌檢測記錄（日常滅菌）
滅菌日期 滅菌時間 沈降菌 檢測日期 檢測人
2010-10-14 1小時
1.5小時
2小時 15 2010-10-14 鄧XX
2010-10-15 10 2010-10-15 梁XX
2010-10-16 8 2010-10-16 林XX
綜合評價
該滅菌基本符合要求
確 認
QA：羅XX
日期：2010-10-17 驗證小組：楊XX
日期：2010-10-17
沈降菌檢測記錄（大消毒）
滅菌日期 滅菌時間 沈降菌 檢測日期 檢測人
2010-10-18 2小時
2.5小時
3小時 8 2010-10-18 楊XX
2010-10-19 5 2010-10-19 張XX
2010-10-20 3 2010-10-20 張XX
綜合評價
該滅菌基本上符合10000級的要求
確 認
QA：朱XX
日期：2010-10-21 驗證小組：諸XX
日期：2010-10-21
生物指示劑檢測記錄（大消毒）
滅菌日期 菌落數 檢測日期 檢測人
2010-10-22
5 2010-10-22
鄧XX
2010-10-23
4 2010-10-23
梁XX
2010-10-24
3 2010-10-24
林XX
綜合評價
該滅菌基本符合要求
確 認
QC：羅XX
日期：2010-10-25 驗證小組：楊XX
日期：2010-10-25
驗證報告
項 目 結果分析與評價 結 論
沈降菌檢查 將安裝在風機送風口的臭氧發生器打開,分別以30min、45min、60min、90min滅菌後取樣，其沈降菌均符合GMP要求。
合 格
整體評價 根據驗證試驗，我公司輸液車間決定采用抽樣滅菌30 min消毒，消毒效果經驗證達到預期標準。
報告審核人： 林XX 日期：2010-11-4
驗證總結
臭氧滅菌早被科學家研究，國家有關行業做過肯定和推薦應用，但臭氧滅菌在藥品生產環境中的應用才是近幾年逐漸被廣泛使用。
臭氧消毒的特點
臭氧消毒滅菌方法與常規消毒滅菌方法相比具有以下特點：
（1）高效性：臭氧消毒不需要其他任何輔助材料和添加劑。消毒進行時臭氧發生裝置產生壹定量的臭氧，在相對密封的環境下，擴散均勻，包容性、通透性好，克服了紫外線殺菌存在的消毒死角的問題，達到全方位、快速、高效的消毒殺菌目的。另外，由於它的滅菌廣譜，既可以殺滅細菌繁殖體、芽胞、病毒、真菌和原蟲孢體等多種微生物，還可以破壞肉毒桿菌和毒素及立克次氏體等，同時還具有很強的除黴、腥、臭等異味的功能。
（2）高潔性：臭臭氧在環境中可自然分解為氧，這是臭氧作為消毒滅菌劑的獨特優點。臭氧利用空氣中的氧氣產生的，消毒氧化過程中，多余的氧原子在30分鐘後又結合成為分子氧，不存在任何殘留物質，解決了消毒劑消毒時，殘留物的二次汙染問題，同時省去了消毒結束後的再次清潔。
（3）方便性：臭氧殺菌設備壹般安裝在室內或中央空調系統、空氣凈化系統中，或者是滅菌設備中。可根據滅菌所需濃度及時間，自動設置臭氧滅菌設備的定時控制，操作使用方便。而甲醛、環氧乙酸熏蒸消毒時間長，而臭氧消毒可以天天定時開啟使用。
（4）經濟性：通過臭氧消毒滅菌在諸多制藥行業GMP中的應用，以及醫療衛生單位的使用及運行比較，臭氧消毒方法與其他方法相比具有很大的經濟效益和社會效益。
經過實踐應用和總結臭氧在制藥行業應用廣泛的有以下幾個方面：
1、潔凈區的消毒滅菌
我國衛生部頒布的“毒技術規範”，對臭氧的殺菌作用，使用範圍及使用方法都有明確的規定。肯定了臭氧是壹種廣譜殺菌劑，可殺滅細菌繁殖體和芽胞、病毒、真菌等，可破壞肉毒桿菌毒素。臭氧的殺菌速度較氯快。
在制藥廠潔凈區面積較大，幾乎都有中央空調凈化系統完成對各潔凈區的凈化消毒。傳統的消毒方法是用甲醛熏蒸，如上所說，甲醛熏蒸的弊病不少。用臭氧滅菌來代替是最簡便易行的好方法。其方法極為簡單，根據潔凈廠房空間的大小取選標準定型的臭氧發生器。然後將臭氧發生器直接放到空調凈化系統的風道中，稱為內置式臭氧發生器。臭氧隨著風道的氣流送入各潔凈區，對潔凈區進行空間消毒滅菌，剩余臭氧吸入風口，由中央空調帶走。也可以將臭氧發生器放置在空調機組中，將臭氧打入中央空調的風道中，然後被送到各潔凈室，稱為外置式臭氧發生器。外置式臭氧發生器安裝檢修方便，但制造成本要高壹點。兩種方法消毒效果是壹樣的。按照衛生部消毒規範，對空氣消毒的臭氧濃度是5ppm,但事實上潔凈區消毒不僅是對空氣的消毒，實際上還包括了設備、器具等物體表面的消毒，所以壹般設計濃度為10ppm，相當於每立方米空氣中臭氧含量20毫克。每天上班前開機兩小時，上班時關機，就可以保證壹天內潔凈區的浮遊菌和沈降菌達到GMP的要求。
2、空間的消毒
對於有些制藥生產工序當沒有中央空調或者不需設中央空調，但房間內需要單獨滅菌處理。方法是根據房間空間大小選取壹定濃度的臭氧發生器，直接安裝在房間內。根據需要設定消毒時間，消毒結束便自動關機，所以使用非常方便。
對於有潔凈度要求的房間，機內裝有過濾器，使臭氧發生器具有自潔功能，以達到消毒和潔凈的目的。
總之，臭氧消毒到目前已在全國制藥行業被廣泛應用。臭氧發生器無論從產品到應用技術方面均得到了很大的提高和發展。在選用時著重要考慮自己的實際情況和適合特點，同時也要考慮其半衰性和衰退性以及投入與經濟效益的關系。以便臭氧在藥品行業得到更好的應用。
以上，僅從幾個方面介紹了臭氧在潔凈區產中的應用，可以看出臭氧在該領域內還是大有作為的。GMP驗證為臭氧技術的開發提供了廣闊的機遇，我們應抓住這個機遇，使其能有所突破。同時，由於臭氧滅菌工藝在藥品生產過程中的成功應用，也為GMP驗證提供了新型的強有力的武器，更有利於藥品生產企業盡快通過GMP驗證。