1.1 DNA重組技術的基本工具
1.為什麽細菌中限制酶不剪切細菌本身的DNA？
提示：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或黴菌中提取出來的，它們各自可以識別和切斷DNA上特定的堿基序列。細菌中限制酶之所以不切斷自身DNA，是因為微生物在長期的進化過程中形成了壹套完善的防禦機制，對於外源入侵的DNA可以降解掉。生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，並且可以防止外源DNA的入侵。
2.天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什麽？
提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質粒（plasmid），即獨立於細菌擬核DNA之外的壹種可以自我復制、雙鏈閉環的裸露的DNA分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。
（1） 載體DNA必需有壹個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至於因目的基因的插入而失活。
（2） 載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。
（3） 載體DNA必需帶有標記基因，以便重組後進行重組子的篩選。
（4） 載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。
（5） 載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。
實際上自然存在的質粒DNA分子並不完全具備上述條件，都要進行人工改造後才能用於基因工程操作。
3.DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領嗎？
提示：迄今為止，所發現的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至於原因，現在還不清楚，也許將來會發現可以連接單鏈DNA的酶。
4.根據妳所掌握的知識，妳能分析出限制酶存在於原核生物中的作用是什麽嗎？
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了壹套完善的防禦機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的壹種防禦性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。
5.DNA連接酶與DNA聚合酶是壹回事嗎？為什麽？
不是壹回事。基因工程中所用的連接酶有兩種：壹種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E?coli連接酶。另壹種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵，那麽，二者的差別主要表現在什麽地方呢？
（1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以壹條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成壹條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。
6.具備什麽條件才能充當“分子運輸車”？
提示：能自我復制、有壹個或多個切割位點、有標記基因位點及對受體細胞無害等。
7.（1）限制酶所識別的序列有什麽特點？
限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到壹條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的。
（2）限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開嗎？
任何壹種限制酶都只識別和切斷特定的核苷酸序列，這是由限制酶的性質所決定的。
（3）DNA連接酶連接的是什麽部位？
DNA連接酶是將壹段DNA片段3′端的羥基與另壹DNA片段5′端磷酸基團上的羥基連接起來形成酯鍵，而不是連接互補堿基之間的氫鍵。
1.2 基因工程的基本操作程序
1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什麽？
答：不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達並發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利於基因的表達；（2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加壹些其他調控元件，如增強子等；（5） 有時需要確定目的基因表達的產物存在於細胞的什麽部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。
2.根據農桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理，妳能分析出農桿菌不能將目的基因導入單子葉植物的原因嗎？若想將壹個抗病基因導入單子葉植物，如小麥，從理論上說，妳應該如何做？
提示：農桿菌可分為根瘤農桿菌和發根農桿菌，在植物基因工程中以根瘤農桿菌的Ti質粒介導的遺傳轉化最多。根瘤農桿菌廣泛存在於雙子葉植物中，裸子植物對該菌也敏感。當這些植物被該菌侵染後會誘發腫瘤。根瘤農桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產生壹些糖類和酚類物質吸引根瘤農桿菌向受傷組織集中。研究證明，這些物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在於單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農桿菌侵染的原因。利用農桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加上述酚類物質的，同時單子葉植物種類不同，農桿菌侵染進行遺傳轉化的效果也有很大差異。如果想將壹個抗病毒基因轉入小麥，也可以用農桿菌，但要註意兩點：①要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導的物質，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的Vir區（誘導）的基因，使T-DNA轉移並插入到染色體DNA上。
3.利用大腸桿菌可以生產出人的胰島素，聯系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考壹下，若要生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？
提示：有些蛋白質肽鏈上有***價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網和高爾基復合體上加工完成的，內質網和高爾基復合體存在於真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產這種糖蛋白是不可能的。
4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓妳用基因工程的方法，使大腸桿菌生產出鼠的β-珠蛋白，想壹想，應如何進行設計？
提示：基本操作如下：
（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。
（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環素的基因，構建成壹個表達載體。
（3）將表達載體導入無四環素抗性的大腸桿菌中，然後在含有四環素的培養基上培養大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環素基因而死掉；如果培養基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。
（4）培養進入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎後從中提取β-珠蛋白。
5.妳能推測出由mRNA反轉錄形成cDNA的過程大致分為哪些步驟嗎？
反轉錄酶既可以利用DNA又可以利用RNA作為模板合成與之互補的DNA鏈。像其他DNA聚合酶壹樣，反轉錄酶也以5′→3′方向合成DNA（圖1-3）。
cDNA合成過程是：第壹步，反轉錄酶以RNA為模板合成壹條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另壹條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。
6.PCR的擴增過程是怎樣的？
PCR擴增是獲取目的基因的壹種非常有用的方法，也是進行分子鑒定和檢測的壹種很靈敏的方法。PCR的擴增反應過程包括以下幾個主要過程。
第壹步：將反應體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應所需的離子等）加熱至90～95 ℃，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為互補鏈聚合反應的模板。
第二步：將反應體系降溫至55～60 ℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈3′端的互補序列互補配對，這個過程稱為復性。
第三步：將反應體系升溫至70～75 ℃，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補的單個核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA鏈延伸，產生壹條與模板鏈互補的DNA鏈。
上述三步反應完成後，壹個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。
7.什麽是分子雜交技術的顯示帶？
分子雜交技術是基因工程中使用頻率很高的壹項技術，主要用於檢測和鑒定，可以分為核酸分子之間的雜交和蛋白質分子之間的雜交。常用的技術有：
Southern雜交──DNA和DNA分子之間的雜交。目的基因是否整合到受體生物的染色體DNA中，這在真核生物中是目的基因可否穩定存在和遺傳的關鍵。如何證明這壹點，就需要通過Southern雜交技術。基本做法是：第壹步，將受體生物DNA提取出來，經過適當的酶切後，走瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的片段分開；第二步，將凝膠上的DNA片段轉移到硝酸纖維素膜上；第三步，用標記了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作為探針與硝酸纖維素膜上的DNA進行雜交；第四步，將X光底片壓在硝酸纖維素膜上，在暗處使底片感光；第五步，將X光底片沖洗，如果在底片上出現黑色條帶，則表明受體植物染色體DNA上有目的基因。
Northern雜交──DNA和RNA分子之間的雜交。它是檢測目的基因是否轉錄出mRNA的方法，具體做法與Southern雜交相同，只是第壹步從受體植物中提取的是mRNA而不是DNA，雜交帶的顯現也與Southern雜交相同。
Western雜交──蛋白質分子（抗原—抗體）之間的雜交。它是檢測目的基因是否表達出蛋白質的壹種方法。
1.3 基因工程的應用
1.表1-1 轉基因生物與目的基因的關系
轉基因生物 目的基因 目的基因從何來
抗蟲棉 Bt毒蛋白基因 蘇雲金芽孢桿菌
抗真菌立枯絲核菌的煙草 幾丁質酶基因和抗毒素合成基因
抗鹽堿和幹旱作物 調節細胞滲透壓的基因
耐寒的番茄 抗凍蛋白基因 魚
抗除草劑大豆 抗除草劑基因
增強甜味的水果 降低乳糖的奶牛
甜味基因 腸乳糖酶基因
生產胰島素的工程菌 人胰島素基因 人
2.利用微生物生產藥物的優越性何在?
所謂利用微生物生產蛋白質類藥物，是指將人們需要的某種蛋白質的編碼基因，構建成表達載體後導入微生物，然後利用微生物發酵來生產蛋白質類藥物。與傳統的制藥相比有以下優越性：（1）利用活細胞作為表達系統，表達效率高，無需大型裝置和大面積廠房就可以生產出大量藥品。（2）可以解決傳統制藥中原料來源的不足。例如，胰島素是治療糖尿病患者的藥物，壹名糖尿病患者每年需用的胰島素需要從40頭牛或50頭豬的胰臟中才能提取到。1978年科學家用2 000 L大腸桿菌發酵液得到100 g胰島素，相當於從1 000 kg豬胰臟中提取的量。又如，生長素是治療侏儒癥患者的藥物，治療壹名侏儒癥患者每年需要從80具屍體的腦下垂體中提取生長素。利用基因工程菌發酵生產就不需要從動物或人體上獲取原料。（3）降低生產成本，減少生產人員和管理人員。
1.4 蛋白質工程的崛起
1.蛋白質工程操作程序的基本思路與基因工程有什麽不同？
答：基因工程是遵循中心法則，從DNA→mRNA→蛋白質→折疊產生功能，基本上是生產出自然界已有的蛋白質。蛋白質工程是按照以下思路進行的：確定蛋白質的功能→蛋白質應有的高級結構→蛋白質應具備的折疊狀態→應有的氨基酸序列→應有的堿基排列，可以創造自然界不存在的蛋白質。
2.妳知道酶工程嗎？絕大多數酶都是蛋白質，酶工程與蛋白質工程有什麽區別？
提示：酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用，借助工程學的手段，應用於生產、生活、醫療診斷和環境保護等方面的壹門科學技術。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產和應用兩方面組成的。酶工程的應用主要集中於食品工業、輕工業以及醫藥工業中。α-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶和葡萄糖異構酶這三個酶連續作用於澱粉，就可以代替蔗糖生產出高果糖漿；蛋白酶用於皮革脫毛膠以及洗滌劑工業；固定化酶還可以治療先天性缺酶病或是器官缺損引起的某些功能的衰竭等。至於我們日常生活中所見到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的體現了。通常所說的酶工程是用工程菌生產酶制劑，而沒有經過由酶的功能來設計酶的分子結構，然後由酶的分子結構來確定相應基因的堿基序列等步驟。因此，酶工程的重點在於對已存酶的合理充分利用，而蛋白質工程的重點則在於對已存在的蛋白質分子的改造。當然，隨著蛋白質工程的發展，其成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質工程的壹部分。
3.對天然蛋白質進行改造，應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因操作來實現？
毫無疑問應該從對基因的操作來實現對天然蛋白質改造，主要原因如下：（1）任何壹種天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且改造過的蛋白質可以遺傳下去。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質分子還是無法遺傳的。（2）對基因進行改造比對蛋白質直接改造要容易操作，難度要小得多。
4.動物乳腺生物反應器？
1987年美國科學家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生產出壹種醫用蛋白──tPA（組織型纖溶酶原激活物），展示了用動物乳腺生產高附加值產品的可能性。利用動物乳腺生產高價值產品的方式稱為動物乳腺反應器。
為什麽要用動物乳腺作為反應器生產高價值的蛋白質產品呢？這是因為動物乳房是壹種高度分化的專門化腺體，合成蛋白質的能力非常強，尤其是壹些經過長期的遺傳改良，專門產奶的乳用動物品種，蛋白質合成能力更是驚人。壹頭優質奶牛，壹年可產奶10 000 kg。即便是壹只奶山羊，壹年也可產奶2 000 kg。動物乳腺生物反應器歸納起來有四大優點：①產量高，且易收獲目標產品，可以隨乳汁分泌而排出動物體外；②目標產品的質量好。動物乳腺組織不僅具有按遺傳信息流向合成蛋白質的能力，而且具備壹整套對蛋白進行修飾和加工的能力，如糖基化、羧化、磷酸化以及分子組裝等，而微生物和植物系統都不具備這種全面的蛋白質後加工能力；③產品成本低；④從奶牛中提取產品，操作比較簡單。