氨基酸的分離鑒定--紙層析 壹、實驗目的 掌握氨基酸紙層析的方法和原理，學會分析待測樣品的氨基酸組成。 紙層析是以濾紙為惰性支持物的分布層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附壹層水作為固定相，有機溶劑作為流動相。當有機相流經固定相時，物質通過兩相之間的連續分配而被分離。 溶質在濾紙上的移動速度用 Rf 值表示：Rf = 從原點到色譜斑中心的距離/從原點到溶劑前端的距離 在某些條件下，物質的 Rf 值是壹個常數。Rf 值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、色譜濾紙的質量和色譜溫度等有關。本實驗采用紙層析法分離氨基酸。 實驗器材 （1）大燒杯（5000mL）：1 個/組 （2）微量註射器（100L）：1 個/組。 (3) 噴霧器：常用。 (4) 培養皿：1 個/組。 (5) 色譜濾紙（長 22cm，寬 14cm 新華 1 號濾紙）：1張/組。 (6) 直尺、鉛筆：自備。 (7) 吹風機：1 個/組。 (8) 托盤、針、白線：1 套/組。 (9) 手套：1 雙/組。 (10) 塑料薄膜：公用。 (11) 小燒杯：50mL，1 個/組。 四、實驗試劑 （1）擴展劑：將 4 體積正丁醇和 1 體積冰醋酸放入分液漏鬥中，與 5 體積水混合，充分振蕩，靜置分層後，棄去下層水。 (2）氨基酸溶液：0.5% 的已知氨基酸溶液 3 種（賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸），0.5% 的待測氨基酸溶液 1 種。 (3）顯色劑：0.1%茚三酮水合物正丁醇溶液。 實驗試劑 五、實驗操作 檢查培養皿是否幹燥、潔凈；若不潔凈，洗凈後放入幹燥箱中 120℃幹燥。 (1）平衡：剪壹大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析筒或大燒杯置於塑料薄膜上，再將盛有約20mL溶液的小燒杯倒置層析筒或大燒杯中，用塑料薄膜密封，平衡20min。 2）制圖：戴上手套，取寬約14cm、高約22cm的層析濾紙壹張。在距濾紙下端邊緣2cm處用鉛筆輕輕地畫壹條與底邊平行的直線A，在直線上做4個記號，記號之間間隔2cm，這就是原點的位置。另在離左邊緣 1cm 處畫壹條與左邊緣平行的直線 B，在 B 上畫壹條以 A、B 兩線的交點為原點的刻度線（單位：厘米），見左圖。 (3）點樣：用微量註射器取約 10mL 的氨基酸樣品（每次點樣前應用蒸餾水洗凈微量註射器，以免交叉汙染），分別點在這四個位置。擠壹滴點壹次，同壹位置上需點 2～3 次，2～3mL/次，每點完壹次後，立即用電吹風熱風吹幹後再點，以保證每個點在紙上擴散的直徑最大不超過 3mm。每人必須點 4 個樣品，其中 3 個是已知樣品，1 個是待測樣品。 (4）層析：用針、線將濾紙縫成圓筒狀，紙的兩側邊緣不能相碰並保持平行，見圖 3-3。向培養皿中加入延伸劑，使液面高度達到 1cm 左右，將點樣好的濾紙筒在培養皿中直立（點樣的壹端在下方，延伸劑水平在線段 A 的下方約 1cm），蓋上大號燒杯，仍用塑料薄膜密封。當延伸器上升到 A 線時開始計時，每隔壹定時間測定延伸器上升的高度，填入表 3-1。當上升到 15 ～ 18cm 時，取下濾紙，剪下線，立即用鉛筆沿線描出溶劑，迅速用吹風機吹幹熱風。 (5）顯色：用噴霧器在通風的廚房內向濾紙上均勻噴灑 0.1%茚三酮正丁醇溶液，然後立即用熱風吹幹，即可顯出色譜斑點，見左圖。 (6）計算各種氨基酸的 Rf 值，並確定混合樣品中有哪些氨基酸，每人將自己的實驗結果貼在實驗報告上，見表 3-2。(7)以層析時間為橫坐標，延伸器上升的高度為縱坐標作圖，求延伸器上升到 18cm 時所需的時間。 (8)用蒸餾水清洗微量註射器內外，倒掉用過的擴增液和平衡液，洗凈培養皿，整理桌上的儀器和試劑。
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