根癌農桿菌介導的遺傳轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，AT-MT）。根癌農桿菌（Agrobacterium tumeficiens）能夠在受傷部位侵染植物，將其Ti質粒上的T-DNA（transfer DNA）轉入植物細胞並整合進植物的基因組。根據農桿菌的這壹特點根癌農桿菌介導植物細胞的轉化已發展成為壹種常用的遺傳轉化方法。除了轉化植物細胞以外，ATMT對酵母、絲狀真菌、動物細胞均實現了成功的轉化。對絲狀真菌轉化來講，傳統的絲狀真菌轉化方法需制備原生質體，而ATMT對絲狀真菌的轉化可以孢子、菌絲等直接作為轉化受體，操作更為簡便。因此，ATMT在絲狀真菌的轉化中的應用日益廣泛，並也被應用在對木黴菌的遺傳轉化中，已經成為最常用的轉化真菌木黴的轉化方法之壹。
8.1.5.1 根癌農桿菌介導轉化原理
根癌農桿菌介導木黴等真菌的轉化原理同對植物的轉化原理基本是壹致的。已有研究表明，根癌農桿菌介導木黴等絲狀真菌的遺傳轉化同樣需要vir基因的表達。目前，對根癌農桿菌介導轉化中參與外源基因轉移的相關基因的轉錄和調控機理已研究得相當深入。其中，農桿菌Ti質粒上毒性基因vir的表達是完成遺傳轉化所必需的。在壹些酚類化合物的作用下，例如乙酰丁香酮，誘導Ti質粒上vir基因的表達，合成T-DNA轉移所需的壹些蛋白質。它們編碼的蛋白質產物參與單鏈T-DNA的合成、加工和轉移等過程。
其中，VirA與VirG為調節蛋白，呈低水平的組成型表達，當外界存在酚類化合物例如乙酰丁香酮等誘導物時，可以激活由vir產生的VirA和VirG組成的雙重調控系統。在特定單糖存在的情況下，染色體基因表達的蛋白質ChvE與VirA相互作用進壹步增強了vir基因的表達水平。VirA是壹種膜鑲嵌蛋白，在乙酰丁香酮的作用下，能夠自動磷酸化，活化後的VirG是壹種DNA結合蛋白，作為轉錄激活因子，能進壹步激活本身基因和vir區其他基因的表達。
T-DNA以單鏈的形式轉入受體細胞，因此，首先是單鏈T-DNA的合成及加工，VirD編碼的產物VirD1和VirD2參與其中。在VirD1協助下VirD2可與T-DNA兩側的邊界重復序列的特定位點結合並切割產生缺口，止於左側邊界重復序列。在靠近右邊界重復序列有壹個25bp的強驅動序列，VirC1蛋白結合在這個地方，也刺激了T-DNA 單鏈的產生。隨後，在DNA聚合酶的作用下，於缺口處進行單鏈T-DNA的復制，當復制進行到另壹缺口時，T-DNA釋放並與VirD2結合為VirD2/T-DNA復合體。
單鏈形成以後，T-DNA就會通過Ⅳ型的分泌機制，穿過細菌的細胞膜和細胞壁，VirB和VirD4蛋白參與了這個過程。VirB編碼產物在細菌的表面形成轉運孔道和T-pilus的結構。virD編碼產物VirD4為膜嵌蛋白，介導VirD2/T-DNA復合體和VirB蛋白復合體的相互作用。VirD2/T-DNA組成的復合體及VirE2和VirE3通過IV型分泌機制轉出細菌。
目前，對單鏈T-DNA復合物進入受體細胞的機制尚不清楚，但對由受體細胞質向細胞核的轉移機制已有了壹些初步的認識，VirD2和VirE3在其中發揮關鍵作用，這兩種蛋白引導T-DNA進入受體細胞核，其中，VirD2含有核定位信號序列NLS，可以與宿主細胞的A核周蛋白（karypherin）發生作用而被轉移到細胞核。同時，VirE3還可以與受體細胞中的A核周蛋白結合而通過依賴於A核周蛋白的途徑被轉運到受體細胞核中，從而引導T-DNA復合物進入細胞核。壹旦進入細胞核內，T-DNA能穩定地整合到基因組中。T-DNA整合的具體機制現在還不很清楚，但宿主的蛋白質應起了重要的作用（Caroline et al.，2005）。
8.1.5.2 根癌農桿菌介導轉化的步驟
（1）雙元載體的構建。雙元表達載體系統實際上就是壹個質粒，雙元載體包含兩個部分，壹個部分是能夠被轉移的T-DNA，另壹個是能夠幫助T-DNA轉移的Vir區。轉移區是有左右邊界的，壹般將含有合適真菌啟動子和終止子的抗性基因插入T-DNA的兩個邊界序列之間，例如潮黴素B基因（hygromycin B phosphotransferase gene），在轉基因時會在左右邊界處斷裂，只將左右邊界以內的T-DNA區域整合到宿主基因組中。雙元表達載體可以通過凍融法、三親交配或電激法轉化（大腸桿菌供體菌+大腸桿菌協助菌+根癌農桿菌受體菌），將構建好的質粒載體轉入根癌農桿菌。根據目的的不同，構建的雙元載體可分為兩種類型：隨機插入型和靶基因插入型的質粒載體。靶基因插入型的質粒載體要在抗性基因兩端連接壹段與目的基因序列同源並且長度合適的DNA片段，通過同源重組造成靶基因的突變。為了基因克隆，還可以在邊界重復序列之間插入適當的克隆載體，使用質粒拯救和TAIL-PCR等方法從轉化子中重新獲得T-DNA和目標基因片段。
（2）根癌農桿菌的活化和培養。從YEP平板上挑取含有雙元載體的根癌農桿菌單克隆菌落接種於含有合適抗生素的7mL YEP液體培養基中，250r/min，28℃過夜培養。次日，用誘導培養基IM（含200μM乙酰丁香酮）稀釋到OD660為0.15，然後繼續培養4～6h至OD660為0.6～0.8。
（3）***培養和轉化子的篩選、鑒定。將100μL誘導活化的根癌農桿菌和等體積的木黴分生孢子懸液混合後均勻地塗布在含有200μM乙酰丁香酮的IM培養基平板上，28℃條件下培養48h，然後在IM培養基平板上覆蓋壹層含100μg/mL潮黴素（或其他抗生素）的PDA培養基（含有50μg/mL的四環素以殺死根癌農桿菌）。繼續培養4～7d，將長出的轉化子挑到含潮黴素培養基上進行篩選培養。將抗性菌轉接到含藥培養基上繼續培養，提取基因組DNA，通過PCR擴增和Southern雜交來鑒定疑似轉化子及插入T-DNA的拷貝數。
8.1.5.3 影響根癌農桿菌介導遺傳轉化效率的因素
ATMT相對於其他轉化方法，雖然具有轉化效率高的特點，但其轉化效率也同樣受諸多因素的影響。這些因素包括根癌農桿菌菌株類型、轉化受體類型、根癌農桿菌與受體的濃度、乙酰丁香酮的濃度和***培養環境條件（時間、溫度、pH值）等。
ATMT受體材料來源廣泛，不僅可以是原生質體，還可以是孢子、菌絲體及子實體組織等，從而擴大了農桿菌介導真菌轉化的範圍。但是個別真菌只能轉化特定的類型。例如，ATMT對粗球孢子菌（Coccidioides immitis）只有以萌發的孢子作為初始材料才能轉化成功，但對根黴菌（Rhizopus oryzae）和毛黴菌（Mucor circinelloides）只有以原生質體為初始材料才可。而對木黴來說，主要用分生孢子和菌絲作為轉化的對象。但不同菌株的轉化效率差別也是很大的。
常用於轉化真菌的農桿菌菌株有AGL-1，EHA105，LBA1100，LBA4404及C58C1等，不同農桿菌菌株對轉化效率的影響很大。對同壹受體材料來說，不同農桿菌菌株對轉化效率影響很大，例如，Kemppainen等（2005）發現對外生菌根生***體Laccaria bicolor來說，根癌農桿菌LBA1100和AGL-1轉化效率相差4倍，AGL-1更適用。高興喜等（2004）用AGL-1和LBA4404對 T.harzianum T88進行遺傳轉化發現，其中 LBA4404並不能轉化T.harzianum T88，而AGL-1轉化T.harzianum T88獲得成功。綜合相關報道可得出具有高Vir毒力的菌株，相對有較高的轉化效率，而且不同菌株和載體類型對轉化效率的影響還具有互作效應。
乙酰丁香酮（AS）是誘導農桿菌毒性基因表達的基本因素，也是轉化成功與否的壹個關鍵因素。AS在根癌農桿菌***培養期間是必需的。***培養前，利用AS對根癌農桿菌進行誘導培養，可以提高轉化效率。其中，***培養基中AS的加入與否直接決定轉化的成功與否，加入的濃度決定轉化效率的高低；誘導過程中不加入AS會導致轉化效率的降低。此外，***培養基中AS濃度會影響T-DNA插入的拷貝數，通常濃度過高會增加T-DNA插入拷貝數。如Mullins等（2001）在轉化尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的過程中發現隨著AS濃度的增加，T-DNA插入拷貝數也增加。
轉化受體的細胞濃度和農桿菌的濃度也會影響轉化效率。隨著受體菌或農桿菌濃度的增加，轉化效率會明顯提高。但兩者作用增長有壹定限度，農桿菌過量會造成轉化效率降低。而且高濃度的農桿菌***培養之後很難抑制其生長，從而影響轉化子的生長。而受體菌濃度過高，會對轉化子的挑取造成困難。
此外，***培養的環境條件（培養溫度、時間和pH值）對轉化效率也有壹定的影響，***培養時間太短不能形成轉化子，隨著***培養時間的延長，轉化子數目相應增加，對於木黴來說，由於生長過快，培養時間過長容易造成菌落重疊，不宜於菌落的篩選，壹般***培養時間控制在24～48h之內。溫度對轉化率的影響沒有***培養時間顯著，溫度範圍壹般為20～37℃，22～25℃為最佳溫度。在比較高的溫度下（＞28℃），根癌農桿菌不能很好地發揮其功能。***培養基的pH值對轉化效率也有明顯的影響，壹般在pH值為6.0左右時效率較高，增加或降pH值都會使轉化效率明顯降低，尤其在高pH值條件下，轉化效率更低，這可能是由於高pH值對毒性蛋白的表達有不良影響。例如，黃亞麗（2008）考察了***培養的環境條件對T.harzianum轉化的影響，發現在壹定範圍內隨著***培養時間的延長、溫度的升高其轉化效率明顯增加。但是，時間過長、溫度太高轉化效率反而降低。以轉化溫度24℃為例，在***轉化24h時轉化效率為14個轉化子/107個孢子，36h為200個轉化子/107個孢子，48h轉化效率最高為275個轉化子/107個孢子，而當***轉化時間延長到72h時，在***培養平板上木黴菌絲生長的過多，當轉到抗性平板後在培養基上出現了大量的背景菌落，可能是因為潮黴素B不能殺死已經過多、過旺生長的木黴菌絲的緣故。***轉化溫度對轉化效率的影響也存在拐點，在溫度低時轉化效率較低，隨著溫度的升高轉化效率逐步提高，等達到壹定溫度後，再提高溫度，轉化效率反而會降低。這可能是因為溫度過高或過低都不利於農桿菌毒性蛋白功能的發揮。對於pH值來說，***轉化在pH值為5.3的環境中最適，增加或降低pH值都會使轉化效率明顯降低，當pH值高於6.5之後幾乎沒有任何轉化子產生。