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分辨率最高的電泳

分辨率最高的電泳是變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

聚丙烯酰胺凝膠電泳,這是壹種用聚丙烯酰胺凝膠作支持介質的常用的電泳技術。它常常用來分離寡合苷酸以及蛋白質。它常作為陰離子的去汙劑,能夠作為助溶試劑和變形劑。在濃縮膠的作用裏面經常提到堆積的作用。濃度比較小的時候,孔徑就會比較大,

作用原理:聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構,具有分子篩效應。它有兩種形式:非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)。

非變性聚丙烯酰胺凝膠,在電泳的過程中,蛋白質能夠保持完整狀態,並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

而SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro於1967年建立,他們發現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去汙劑和強還原劑(SDS即十二烷基硫酸鈉)後,蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小。

作用:

SDS是陰離子去汙劑,作為變性劑和助溶試劑,它能斷裂分子內和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇,二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。

在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS後,分子被解聚成多肽鏈,解聚後的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束,所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量,這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。

SDS-PAGE壹般采用的是不連續緩沖系統,與連續緩沖系統相比,能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至壹個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCI緩沖液,電極液選TRIS/甘氨酸。

電泳開始後,HCI解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷,因此壹起向正極移動,其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中。

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