(壹) 方法原理
蛋白質有兩個以上的肽鍵, 因此有雙縮脲反應。在堿性溶液中蛋白質與Cu++ 形成紫紅色絡合物, 其顏色深淺與蛋白質的濃度成正比, 而與蛋白質的分子量及基酸成分無關。顯色反應受溫度影響頗大, 在常溫(20～25℃)下需1小時, 40℃需15分鐘, 60℃需5分鐘。
(二) 儀器、設備
1. 儀器 光電比色計；離心機(4000轉/分)；分析天平(感量0.0001克或0.001克)；恒溫振蕩器或恒溫水浴鍋；離心管、刻度吸管。
2. 試劑 4%硫酸銅(CuSO4 ·5H2 O)溶液；2.5%酒石酸鉀鈉溶液；雙縮脲試劑配制: 在500毫升容量瓶中, 依次加入4%CuSO4 ·5H2 O 30毫升和2.5%酒石酸鉀鈉100毫升, 再慢慢加入5mol/L KOH 30毫升, 最後用蒸餾水稀釋至刻度。使用時,再將上述溶液與透明度良好的異丙醇混合。
(三) 測定步驟
1. 酪蛋白標準曲線制備: 稱取國產酪蛋白質2克(磨細至80目)於0.15mol/L KOH溶液中, 加熱溶解並定容至100毫升, 分別取此溶液0.2～0.9毫升8份, 加入10毫升雙縮脲試劑, 在60℃的恒溫水浴振蕩器中振蕩5分鐘顯色完全, 隨後以4000轉/分離心10分鐘,取離心液在波長550nm下, 以1cm比色杯進行比色測定, 空白為不加酪蛋白的試劑。同時取此溶液5毫升(雙樣)進行凱氏定氮, 乘以換算系數6.41即為酪蛋白含量。根據測得的光密度值與相應酪蛋白含量進行回歸, 算出回歸方程式Y=a+bX(X為酪蛋白光密度,Y為相應酪蛋白含量克)。
2. 樣品處理與測定: 樣品粉碎磨細通過40目篩孔, 以風幹重樣品或烘幹重樣品測定蛋白質含量。在分析天平上準確稱取待測樣品0.1000克, 放入幹燥的25毫升凱氏消化瓶或大試管中, 內放幾粒玻璃珠, 加入10毫升雙縮脲試劑, 在60℃的恒溫水浴振蕩器上振蕩5分鐘, 隨後以4000轉/分離心10分鐘, 取離心液在波長550nm下,以1cm比色杯進行比色測定, 空白為不加樣品的試劑溶液。
(四) 結果計算
將樣品測得的光密度值代入酪蛋白回歸方程Y=a+bX(其中X表示樣品光密度值,Y代表樣品蛋白質含量克)。再乘以釋倍數1000,即為100克樣品中蛋白質含量(克)。
附註:
(1) 對含脂肪高的樣品溶液與雙縮脲試劑混合後, 若有霧狀沈澱,需讓其靜置二小時以上, 再離心, 取其清液比色。
(2) 異丙醇可降低澱粉的溶解性,有利於蛋白質提取及顯色。
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