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用疏水層析法分離蛋白類藥物的具體步驟

超濾是壹種分子水平的膜過濾手段,以超濾膜為分離介質,以膜兩側的壓力差為驅動力,對不同分子量的溶質進行選擇性分離。超濾過程壹般在室溫和低壓下進行,最適用於分離熱敏性、保味性和化學性質易變的物質。它主要用於生物合成藥物中大分子物質的分級分離和脫鹽濃縮、小分子物質的純化以及藥物和生化制劑的脫熱處理。

1 除熱原

制劑中熱原的去除壹般采用活性炭反復吸附的方法,該方法勞動強度大、損耗高、收率低。超濾去除熱原的原理是利用小於熱原分子量的超濾膜攔截熱原,該方法已通過美國食品藥品管理局認證,具有勞動強度低、產品收率高、產品質量好等優點。

上海第四制藥有限公司采用卷式超濾小裝置,以分子量為20000的截留膜進行了硫酸(雙氫)鏈黴素除熱原的試驗,試驗結果表明,用超濾代替傳統的活性炭吸附熱原,對於生產硫酸(雙氫)鏈黴素是可行的。上海福達藥業有限公司采用截留分子量為 10000 的磺化聚醚碸膜(SPES)對黃芪註射液的熱原進行超濾去除,再用活性炭吸附,使產品的熱原合格率從原來的經常波動到現在的 100%合格。上海天廚味精廠采用截留分子量為10000的SPES超濾膜去除丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸等氨基酸溶液中的熱原,經鱟試劑法檢測,結果均為陰性。

由於藥液中的有效成分(如黃酮、生物堿、總苷等)分子量都在 1000 以下。因此,藥物制劑尤其是註射劑使用超濾最適合去除熱原。空軍北京醫院藥劑科用超濾法制備復方丹參、銀梔子花、生脈3種復方中藥註射劑,所得超濾產物澄清度良好,放置3個月後未出現沈澱。用化學分析方法測定註射液中鞣質、蛋白質、澱粉等項目的含量,結果表明超濾產品中上述雜質含量均低於衛生標準,除雜效果很好。實驗證明,經超濾處理的去皮註射液不會造成原配方有效成分的損失。例如,復方丹參超濾產品中測得的 281nm 光密度值較高,薄層色譜法檢測到原兒茶醛斑點,可見斑點及其熒光斑點多而清晰。張映輝采用超濾法去除人參皂甙熱原,發現:超濾法能有效去除熱原,並能有效減少總人參皂甙的損失,方法簡便、可靠、有效,可用於去除人參皂甙熱原。

北京中醫藥大學藥學院比較了活性炭和超濾兩種工藝,發現對於清開靈註射液除熱原,兩種工藝均可行,但超濾法得到的產物:黃岑苷含量高,產物顏色淺,顆粒數明顯少。用超濾膜過濾川參註射液、冠舒註射液、松梅樂註射液和大輸液中的焦磷酸,實驗表明,藥液經超濾後,焦磷酸的截留率獲得滿意的結果,符合藥典規定,去除焦磷酸是可靠的。超濾不僅能去除熱原,還能去除大於膜孔徑的大分子物質,提高註射液的澄清度和穩定性,而且超濾膜孔徑越小,脫色效果越明顯。

2 小分子物質的精制

對於抗生素類小分子物質,其傳統的生產工藝,經過過濾、提取、濃縮、結晶等過程,存在流程長、收率低、能耗大等缺點,而且在精制過程中有微量的大分子雜質殘留,如蛋白質、核酸、多糖等,可能對人體產生副作用。利用超濾膜可以去除大分子雜質,簡化操作過程。

青黴素是壹種熱敏性物質,其活性單位受環境影響較大,溫度稍高或加工時間過長都會導致活性單位降解。因此,青黴素的精制要求在 15℃以下快速完成。目前,在青黴素精制過程中,需要添加十五烷基溴化吡啶作為破乳劑,這種破乳劑有毒且價格昂貴。采用超濾工藝可以去除發酵副產物和殘留物以及壹些可溶性蛋白質,無需添加破乳劑,而且工藝簡單、速度快。

超濾系統已應用於紅黴素、青黴素、頭孢菌素、四環素、林可黴素、慶大黴素、利福平等抗生素的過濾生產。美國默克公司采用截留分子量為24000的超濾膜過濾頭孢黴素發酵液,收率比帶助濾層的鼓式真空過濾機高2%,達到98%,材料成本降低2/3,設備投資成本降低20%。此外,使用超濾膜能有效處理頭孢菌素 C 發酵液,不堵塞或汙損膜,提高回收率,使濃縮液中頭孢菌素 C 的濃度高於原發酵液中的濃度。韓紹咀等用超濾膜提純螺旋黴素,發現:截留分子量為5000的芳香族聚酰胺超濾膜可以去除蛋白質等大分子雜質,起到納濾預處理的作用。

維生素 C 是人體必需的營養物質,在醫學和營養學中有著廣泛的應用。目前,生產維生素 C 的方法主要有兩種:萊式法和兩步發酵法。兩步發酵法是我國科學家首創的生產工藝,這種工藝往往采用加熱沈澱法除去雜質,耗能大,導致有效成分古洛尼克酸的損失,產量也低。采用超濾膜系統代替加熱沈澱法除去發酵液中殘留的菌絲、蛋白質和懸浮顆粒等雜質,省去了預處理、加熱、離心等工序,既節約了能源又提高了古龍水的收率。

中藥中大部分有效成分的分子量不超過 1000,而澱粉、多糖、蛋白質、樹脂等無效成分和其他雜質的相對分子質量都在 50000 以上。因此,具有合適截留分子量的超濾膜可以輕松地將二者分離。與傳統的化學分離法相比,膜分離法不僅效率高、操作簡便,而且成本低、經濟效益好,因此被越來越多的人所采用。

3 大分子物質的精制

隨著生物技術的發展,大分子藥物的數量急劇增加,由於這類產品的熱不穩定性,超濾的低溫快速過濾特點成為精制這類物質的重要方法。

利用截留分子量為 20,000 PS 的管式超濾膜系統濃縮植酸酶發酵液的實驗表明,植酸酶的濃縮倍數可達 6.53 倍,濃縮產率為 99.69%,截留率為 99.93%。

利用PAN超濾膜分離純化藏牦牛血中凝血酶的實驗表明,獲得的凝血酶平均比活度為38.24 IU/mg,是傳統方法的2倍。

利用超濾膜從豬血中純化SOD有三個優點:(1)去除大量小分子雜質;(2)濃縮SOD可節省後續沈澱SOD所需的溶劑;(3)可大大提高後續熱變性純化的效果,SOD總回收率可達62%,比活度可達5000U/mg。

在丙種球蛋白產品的生產中,將采用超濾技術進行蛋白質脫氫。超濾技術用於蛋白質脫氫和濃縮。

超濾技術可用於人血白蛋白的濃縮和脫氫。

利用超濾技術濃縮和分離免疫初乳中的抗體,這些應用都取得了良好的濃縮效果。

利用超濾單獨分離高分子多糖類化合物,制備具有特殊藥理作用的藥物,使不同分子量的中藥成分達到不同的治療目的,實現藥物的綜合利用,是膜分離的壹項重要功能。

選用截留分子量為50000的PS超濾膜代替醇沈法處理板藍根水提液,實現了高效節能。

利用CA超濾膜濃縮銀耳提取物,產品收率比傳統濃縮法提高了22.4%,同時濃縮時間縮短。

利用超濾和重濾改進了香菇多糖的提取純化工藝,提高了產品收率,降低了生產成本。

采用超濾代替透析去除海洋真菌多糖提取物中的小分子雜質,結果表明,超濾得到的產品收率和多糖含量均高於透析對照組,此外,多糖中的大部分色素會被超濾膜吸附,有利於粗品中多糖含量的提高。

中空纖維超濾膜能有效提取六味地黃湯中的活性多糖,工藝簡單,生產周期短。

4 膜蒸餾

膜蒸餾是利用疏水性微孔膜將兩種不同溫度的水溶液分開,在膜兩側水蒸氣壓差的作用下,熱側的水蒸氣通過膜孔進入冷側,冷側的水蒸氣冷凝下來。膜蒸餾與常規蒸餾中的蒸發-轉移-冷凝過程是壹樣的。兩者都以氣液平衡為基礎,都需要蒸發潛熱來實現相變。與傳統分離過程相比,其優點在於理論上可100%分離離子、大分子、膠體、細胞等非揮發性物質;②操作溫度低於常規蒸餾過程;③操作壓力低於該過程;④對膜的機械性能要求低;⑤適合分離特殊物質,且可分離濃度極高的物質,甚至可產生晶體;⑥效率高。膜蒸餾用於熱敏性物質的濃縮,可以很好地發揮其低溫濃縮的特點。青黴素作為抗生素應用於臨床已有 50 年之久,壹般采用溶劑萃取法提取,但萃取工藝復雜。采用直接接觸膜蒸餾法濃縮青黴素水溶液,濃縮過程更穩定。益母草和芍藥是常用的中藥,而水楊酸和芍藥苷是它們的指標成分,均為水溶性,沸點高於水。采用真空膜蒸餾法濃縮益母草和芍藥的提取物是可行的,具有效率高、能耗低、操作方便、有效成分保留率達 100%等優點。

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