摘要] 目的：探討吡咯類抗真菌藥物制劑微生物限度檢查方法的建立。目的：探討吡咯類抗真菌藥物制劑微生物限度檢查方法的建立。方法：通過預試驗摸底，提出以組氨酸、卵磷脂和聚山梨醇酯80混合溶液作為稀釋液和漂洗液，采用離心沈澱集菌法結合膜過濾法對該類藥物進行微生物限度檢查，並對方法學進行了驗證。結果：根據《中國藥典》2005 年版附錄的要求，對所提出的方法進行了驗證，驗證菌株的回收率均大於 70%，對照細菌檢查的陽性菌也生長良好。結論：以組氨酸、卵磷脂和聚山梨醇酯80混合溶液為稀釋液和漂洗液，采用離心沈澱集菌法和膜過濾法對吡咯類抗真菌藥物制劑進行微生物限度檢查是可行的。
[關鍵詞] 吡咯類抗真菌藥物制劑；微生物限度檢查；離心沈澱集菌法；膜過濾法
吡咯類抗真菌藥物，如硝酸布發康唑、克黴唑等，具有廣譜抗真菌活性，對表皮葡萄球菌、大腸桿菌、大腸埃希菌等有良好的抗菌活性。對表皮葡萄球菌、毛黴菌、曲黴菌、著色葡萄球菌、隱球菌和念珠菌具有良好的抗菌活性。這些藥物通過幹擾細胞色素 P-450 的活性，抑制真菌細胞膜的主要固醇麥角固醇的生物合成，破壞真菌細胞膜並改變其通透性，從而導致細胞內重要物質的泄漏、還能抑制真菌三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和過氧化酶的活性，造成細胞內過氧化氫積累，導致細胞亞顯微變性和細胞壞死。和細胞壞死。這類藥物對細菌也有壹定的抑制作用。根據目前國內的要求，非無菌藥物制劑微生物限度的建立包括抗菌藥和抗真菌藥，但由於此類藥物具有較強的抗菌活性，因此如何消除其抑菌性，使試驗能順利進行就成為建立方法中最重要也是較難的關鍵點。在本文中，作者選擇了吡咯類抗真菌藥物制劑（如硝酸布康唑和硝酸布康唑）作為研究對象、硝酸布康唑和克黴唑）進行實驗研究，經過多次試驗，重點對漂洗液的組成和漂洗液的用量進行考察和優選，最終參照歐洲藥典確定了含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨醇酯 80 的混合溶液作為稀釋劑和漂洗液，並用離心沈澱法收集漂洗液中的細菌。將離心沈澱集菌法與膜過濾法結合使用，建立了硝酸布法康唑和克黴唑藥物制劑的微生物限度檢查方法，並對該方法進行了驗證，結果表明該方法適用可行。
1.供試藥物和儀器
1.1種供試藥物
硝酸布發康唑陰道乳膏3批次、2個廠家生產的克黴唑陰道片3批次、復方克黴唑乳膏3批次、克黴唑乳膏3批次、醋酸咪康唑乳膏3批次，均為市售藥物；營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰瓊脂培養基、膽鹽、乳 糖培養基、十六烷基溴和溴。乳糖培養基、十六烷基三甲胺溴化物瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基購自中國藥品生物制品檢定所；組氨酸、卵磷脂、聚山梨醇酯 80、蛋白腖、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為市售分析純試劑和試藥；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草桿菌[CMCC(B ) 63501]、大腸桿菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和黑曲黴[CMCC(F)98003]、以上菌株均購自中國藥品生物制品檢定所菌種室，並按照《中國藥典》2005 年版附錄的要求制備成驗證菌型。將上述 5 種驗證菌配制成每 1 ml 含 50~100 cfu 的菌液。
1.2儀器
潔凈工作臺、醫用吸引器、低速離心機等。
2方法與結果
2.1藥典附錄方法試驗結果
將上述藥物用《中國藥典》2005年版推薦的常用稀釋液（pH7.0）配成1:10的試液，依次采用藥典附錄中的幾種消除藥物抑制的處理方法，即、依次采用藥典附錄中的幾種消除藥物抑菌性的方法，即：培養基稀釋法（1:10 的試液每皿 0.2 毫升或 1:100 的試液每皿 0.2 毫升）、離心沈澱法收集細菌和以 pH 值為 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液為漂洗液的膜過濾法，以及離心沈澱法收集細菌和膜過濾法相結合的菌落計數法。
2.2 回收率的測定
即使采用了處理強度較高的離心沈降法和膜過濾法，5 個驗證菌株中有 4 個菌株的回收率為零，說明吡咯菌的回收率較高。回收率為零，說明吡咯類抗真菌藥物對細菌和真菌有很強的抑制作用，或者說膜對這類藥物有很強的吸附性，常用的漂洗液很難將其漂洗幹凈，國內常用的幾種都不適用於這類藥物的處理。
2.3不同配方稀釋液和沖洗液的效果比較
參照《中國藥典》2005年版[1]和《歐洲藥典》第5版[2]，配制了以下5種稀釋液和沖洗液，見表2。
選取壹批克黴唑陰道片，依次對上述5種稀釋液和沖洗液進行試驗，並采用離心沈澱法與膜過濾法結合比較實驗效果。
上述結果表明，使用歐洲藥典配方溶液和進口試劑卵磷脂，或使用自擬的No.5 溶液作為稀釋液和漂洗液，在消除藥物的抑菌作用方面效果比較理想，但當卵磷脂改為國產試劑時，由於溶液渾濁，無法過濾。當卵磷脂和聚山梨醇酯 80 的用量減少到歐洲藥典配方用量的壹半時，溶液澄清度不受試劑質量的影響，漂洗效果也能達到實驗要求。.4 方法的建立
2.4.1 方法的建立根據上述試驗結果取供試品 10 g，加入含無菌組氨酸-卵磷脂-聚山梨醇酯 80 的混合溶液（制備方法見後）至 100 ml，於 45℃保溫振蕩至供試物質分散均勻，制成 1:10 的均勻供試物質儲備液。細菌計數、黴菌和酵母菌計數采用離心沈澱和膜過濾法。取 50 毫升 1:10 的儲備液，以 500 轉/分的轉速離心 5 分鐘，取全部上清液，將上述混合物加入 50 毫升中，然後以 3,000 轉/分的轉速離心 20 分鐘，取約 5 毫升底部細菌收集液，將上述混合物加入 50 毫升中，即得 1:10 的儲備液（膏霜等制劑可省略沈澱步驟）。取1毫升1:10供試品溶液，加至100毫升上述混合溶液中，全部用濾膜過濾，以上述混合溶液作為沖洗液，每次沖洗100毫升，***沖洗3次，取濾膜，依法檢查（《中國藥典》2005年版二部附錄ⅪJ）。
2.4.2對照菌檢查（如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等）采用離心沈澱集菌法結合膜過濾法。取上述菌落計數項下的 1:10 供試品溶液 10 ml，加入上述混合溶液 100 ml 中，用濾膜過濾，同菌落計數項下的方法沖洗，將濾膜接種於相應的培養基中，依法檢查（《中國藥典》2005 年版二部附錄ⅪJ）。
2.4.3 無菌組氨酸-卵磷脂-聚山梨酯 80 混合溶液的制備方法 聚山梨酯 80 15 g，卵磷脂 1.5 g，組氨酸 0.5 g，蛋白腖 0.5 g，氯化鈉 2.15 g，磷酸二氫鉀 1.8 g，磷酸氫二鈉 3.6 g，水 1 000 ml 將溶液混勻，微溫溶解，分裝，滅菌。
2.5驗證試驗
上述方法按《中國藥典》2005年版附錄的要求進行了驗證。
2.5.1細菌計數、黴菌和酵母菌計數方法的驗證 菌液組：取上述 5 種菌液各 1 ml，用培養皿計數法測定配制菌液中每 ml 的活菌數。參比組：取 1:10 參比溶液 1 毫升，加入上述混合溶液 100 毫升，全部用濾膜過濾，沖洗方法同上，取濾膜，在規定溫度下培養，計數。試驗組：取 1:10 供試品溶液 1 ml，按試驗對照組相同方法操作，在第三次沖洗液中 加入上述菌液 1 ml（供試菌 50~100 cfu），取濾膜，在規定溫度下培養，計數，計算 回收率，見表 4。 稀釋液對照組：取上述 5 種菌液各 10 ml（供試菌 500~1,000 cfu），按試驗對照組 相同方法操作，計算回收率，見表 5。稀釋液對照組：取上述 5 種菌液（500～1000 cfu 試驗菌）各 10 ml，按與供試 物相同的方法操作，計算回收率，見表 4。按下式計算回收率（%）：
上述實驗表明，各驗證菌的回收率均符合藥典附錄的要求，說明用此方法進行該類藥品中細菌、黴菌和酵母菌計數是可行的。
2.5.2對照菌檢查法驗證 試驗組：取上述 1:10 供試液 10 ml，加入上述混合溶液 100 ml 中，用濾膜過濾，沖洗方法同上，濾膜加入相應培養基 100 ml 中進行細菌富集培養，作為試驗組。空白對照組：取上述混合溶液 10 毫升，按同樣方法操作，作為稀釋液空白對照組。陰性菌對照組：取 10 ml 1:10 供試品溶液，加入 100 ml 上述混合溶液中，用膜濾器過濾，沖洗方法同上，但在第 3 次沖洗液中加入 10~100 cfu 適當的陰性對照菌（如大腸埃希氏菌檢查選用金黃色葡萄球菌作為陰性對照菌），然後將膜加入相應培養基 100 ml 中進行細菌富集培養，作為陰性菌對照組。陰性菌對照組。陽性菌對照組：取 1:10 的試液 10 ml，加入上述混合溶液 100 ml 中，用膜濾器過濾，沖洗方法同上，但在第 3 次沖洗液中加入 10~100 cfu 的合適細菌（如金黃色葡萄球菌試驗用金黃色葡萄球菌），然後將膜加入相應的培養基 100 ml 中，作為陽性菌對照組。
將上述各組分別置於35～37℃培養18～24 h，分別行於相應培養基中，再置於35～37℃培養18～24 h，結果陽性菌對照組均生長良好，說明經本方法處理過的藥物無抑菌作用或其抑菌作用可忽略；陰性菌未檢出，說明對照檢菌方法的排他性，說明本方法陰性菌未檢出。
三、討論
本實驗研究表明，吡咯類藥物同時對細菌和真菌有較強的抑制作用，對於這類抗菌活性較強的藥物必須先找出消除其抑制作用的處理方法，其微生物檢出限才能順利進行。
如果采用膜過濾法對藥物進行微生物限度檢查，所用稀釋劑和沖洗液的種類和用量非常重要，甚至可以決定該方法的適用性。作為微生物限度檢測的稀釋液和沖洗液，不僅要具有溶解藥物的功能，還要具有維持細菌細胞膜的通透性、修復受損細胞、破壞藥物對細菌細胞的損害等功能。在本實驗確定的漂洗液處方中，組氨酸是白色念珠菌生長的重要氮源之壹；卵磷脂能起到修復細胞膜的重要作用；聚山梨醇酯 80 作為表面活性劑，能降低菌體周圍與培養基接觸面之間的表面張力，使外周營養物質更快地進入細胞，從而促進菌體更快地生長等活動。卵磷脂和聚山梨醇酯 80 配合使用可以中和抑菌劑，中和後的產物對細菌和培養基的影響很小，因此在稀釋液和漂洗液中加入這些物質可以有效降低藥劑對細菌和真菌的抑制作用，同時促進受損細菌和真菌的生長。
有些國產試劑、試藥與進口產品存在壹定的質量差異，歐洲藥典收載的沖洗液配方中卵磷脂和聚山梨醇酯 80 含量較多，用國產產品配制時，其溶解性能不好，導致溶液渾濁，沖洗量大，溶液過濾速度慢，影響沖洗效果，甚至無法過濾。通過減少配方中各組分的用量，可以有效解決這壹問題。實踐證明，即使將配方中各組分的用量減少壹半，效果仍能滿足實驗需要，而且過濾速度適宜，還能降低實驗成本。
【參考文獻】
[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].第二部.北京：化學工業出版社，2005.
[2]歐洲藥典[S].第五版.附錄 XVI B.A377.
[3] 歐洲藥典[S].