如今，在壹項新的研究中，來自美國哈佛大學威斯生物啟發工程研究所、麻省理工學院和波士頓地區幾家醫院的研究人員開發出壹種廉價的、基於CRISPR的診斷測試，允許用戶在家裏使用唾液樣品對自己進行SARS-CoV-2及其多種病毒變體的測試，而不需要額外的儀器。相關研究結果發表在2021年8月6日的ScienceAdvances期刊上，論文標題為“MinimallyinstrumentedSHERLOCKforCRISPR-basedpoint-of-carediagnosisofSARS-CoV-2andemergingvariants”。
這種稱為MinimallyInstrumentedSHERLOCK的診斷設備易於使用，提供的結果可在壹小時內由配套的智能手機應用程序讀取和驗證。它在實驗中成功區分了SARS-CoV-2的三種不同變體，並且可以迅速重新配置以檢測更多的變體，如Delta變體。該設備可以用三維打印機和常見的部件組裝，價格約為15美元，重復使用這些部件使單個檢測的成本降至6美元。
論文***同第壹作者、哈佛大學威斯生物啟發工程研究所和麻省理工學院的博士後研究員HelenadePuig說，“miSHERLOCK消除了將患者樣品運送到集中測試地點的需要，並大大簡化了樣品制備步驟，使患者和醫生能更快、更準確地了解個人和社區的健康狀況，這在不斷發展的大流行病中至關重要。”
從供應鏈到SHERLOCK
作為波士頓兒童醫院專門研究傳染病的兒科講師，論文***同第壹作者RoseLee博士已在COVID-19大流行病的前線工作了壹年多。她在診所的經歷為最終開發miSHERLOCK的項目提供了靈感。
Lee說，“以前在醫院裏隨處可見的壹些簡單的東西，比如鼻咽拭子，突然變得難以獲得，因此常規的樣品處理程序被打亂了，這在流行病背景下是壹個大問題。我們團隊開展這個項目的動機是為了消除這些瓶頸，在不太依賴全球供應鏈的情況下為COVID-19提供準確的診斷方法，並且還可以準確地檢測開始出現的病毒變體。”
對於他們診斷設備的SARS-CoV-2檢測部分，這些作者選擇了論文通訊作者、哈佛大學威斯生物啟發工程研究所核心教員JimCollins博士的實驗室構建的基於CRISPR的技術，稱為SHERLOCK。SHERLOCK利用CRISPR的“分子剪刀”在特定的位點切割DNA或RNA，這還有壹個額外的好處：這種特定類型的分子剪刀也會切割周圍區域的其他DNA片段，使其能夠切割攜帶熒光信號的單鏈核酸探針分子，從而產生表明靶標已被成功切割的熒光信號。
該診斷程序只需要用戶將口水吐進樣品制備室，然後將收集盤轉移到反應室，並按下柱塞，從而激活反應，並將交叉汙染的風險降到最低。圖片來自ScienceAdvances，2021，doi：10.1126/sciadv.abh2944。
這些作者創建了壹種SHERLOCK檢測，旨在切割SARS-CoV-2的核蛋白編碼基因的特定區域，該特定區域在該病毒的多個變體中是保守的。當這種稱為Cas12a的分子剪刀成功地結合並切割NP基因時，附近的單鏈DNA探針也被切割，從而產生熒光信號。他們還創建了額外的SHERLOCK檢測，旨在靶向刺突蛋白序列中的壹組病毒突變，這些突變代表了三種SARS-CoV-2病毒變體：Alpha、Beta和Gamma。
有了能夠可靠地在美國食品藥品管理局授權的診斷測試的可接受濃度範圍內檢測病毒RNA的檢測方法，這些作者接下來集中精力解決診斷中可能最困難的挑戰：樣品制備。
吐口水、等待、掃描
論文***同第壹作者、哈佛大學威斯生物啟發工程研究所臨床研究員XiaoTan博士說，“當妳測試樣品中的核酸時，妳需要做很多步驟來制備樣品，以便妳能真正提取和擴增這些核酸。妳必須在樣品運送到檢測機構的過程中保護它，而且如果妳處理的是可傳播的疾病，還要確保它不具有傳染性。為了使它成為壹種真正易於使用的診斷測試，我們必須盡可能地簡化它。”
這些作者選擇使用唾液而不是鼻咽拭子樣品作為他們的收集方法，因為用戶更容易收集唾液，而且已有研究表明SARS-CoV-2在感染後的更多天內可在唾液中檢測出來。但是未經處理的唾液也帶來了自身的挑戰：它含有降解各種分子的酶，產生的假陽性率很高。
這些作者開發了壹種新技術來解決這個問題。首先，他們在唾液中加入了兩種名為DTT和EGTA的化學物質，並將樣品加熱到95°C3分鐘，這就消除了未經處理的唾液中的假陽性信號，並裂開任何病毒顆粒。然後他們加入了壹種多孔膜以便在其表面捕獲RNA，最後可以直接加入到SHERLOCK反應中以產生檢測結果。
為了將唾液樣品制備和SHERLOCK反應整合到壹種診斷設備中，這些作者設計了壹種簡單的電池供電設備，有兩個腔室：壹個加熱的樣品制備室和壹個不加熱的反應室。用戶向樣品制備室吐口水，對它進行加熱，等待三至六分鐘，唾液就會進入過濾器。用戶取出過濾器並將其轉移到反應室的柱子上，然後按下柱塞，將過濾器放入反應室，並刺穿蓄水池，以激活SHERLOCK反應。55分鐘後，用戶通過有色透光器窗口觀察反應室，確認是否存在熒光信號。他們還可以使用壹種配套的智能手機應用程序，分析智能手機攝像頭記錄的像素，從而提供明確的陽性或陰性診斷結果。
這些作者用27名COVID-19患者和21名健康患者的臨床唾液樣品測試了他們的診斷設備，發現miSHERLOCK在96%的時間裏能正確識別COVID-19陽性患者，在95%的時間裏能正確識別無該疾病的患者。他們還通過將含有代表每種病毒變體的突變的全長合成病毒RNA加入健康人的唾液中，測試了這種診斷設備檢測SARS-CoV-2Alpha、Beta和GammaSARS-CoV-2變體的性能，並發現該設備在各種病毒RNA濃度下都有效。
論文***同第壹作者、Collins實驗室研究助理DevoraNajjar說，“miSHERLOCK的優點之壹是它是完全模塊化的。該設備本身與檢測方法是分開的，因此妳可以整入不同的檢測方法來檢測妳想要檢測的特定RNA或DNA序列。該設備的成本約為15美元，但大規模生產將使之降至約3美元。可以在大約兩周內建立新靶點的檢測方法，從而能夠快速開發針對COVID-19和其他疾病的新變體檢測方法。”
為現實應用做好準備
這些作者在構建他們的診斷設備時考慮到了低資源環境，因為這種大流行病讓人們看到了世界不同地區之間在醫療服務方面存在的巨大不平等現象。該設備的組件可以由任何能夠使用三維打印機的人制造，相關的資料文件和電路設計都可以在網上公開獲得。增加壹種智能手機應用程序也是針對資源有限的環境，因為移動電話服務幾乎在世界任何地方都可以使用，甚至在步行難以到達的地區。他們渴望與那些有興趣大規模生產miSHERLOCK以進行全球分銷的制造商合作。
Collins說，“當miSHERLOCK項目開始時，幾乎沒有進行SARS-CoV-2變體監測。我們知道，在評估COVID-19對當地和全球社區的長期影響時，這種病毒變體跟蹤將是非常重要的，所以我們推動自己構建壹種真正分散管理的、靈活的、用戶友好的診斷平臺。通過解決樣品制備問題，我們已經確保這種設備實際上準備好供消費者使用，我們很高興與工業夥伴合作，使其商業化。”
哈佛大學威斯生物啟發工程研究所創始主任DonIngber博士說，“通過將前沿生物技術與低成本材料相結合，這個研究團隊構建出壹種強大的診斷設備，可以由沒有高級醫學學位的人在當地制造和使用。這是壹個完美的例子，說明了哈佛大學威斯生物啟發工程研究所的使命：將改變生活的創新交到需要它們的人手中。”
參考資料：
HelenadePuigetal.MinimallyinstrumentedSHERLOCKforCRISPR-basedpoint-of-carediagnosisofSARS-CoV-2andemergingvariants.ScienceAdvances，2021，doi：10.1126/sciadv.abh2944.