麥角[Claviceps purpurea (Fr.) Tul.]屬子囊菌亞門,核菌綱,麥角目,麥角科,麥角屬,是寄生在小麥子房上形成的壹年生真菌菌核。世界各地均有分布,主產於蘇聯、波蘭、西班牙等國。我國在河北、遼寧、吉林、黑龍江、江蘇、山西、山東、內蒙古、新疆、安徽、浙江、甘肅、臺灣、湖南、湖北、四川、貴州、青海、江西和廣西等省區均有分布,其中以黑龍江、河北和內蒙古等省區為最多。菌核可入藥。由於麥角(木耳)含有麥角胺、麥角堿、麥角生物堿、麥角生物堿、麥角坤寧堿、麥角生物堿、麥角生物堿、麥角生物堿、胺類、維生素D2等,自古麥角就是婦產科臨床常用的重要藥物。主要用於產後止血和促進產後子宮恢復。麥角生物堿作用最強,毒性最小。近年來,許多文獻報道麥角生物堿及其衍生物在治療偏頭痛和心血管疾病方面效果顯著,並在眼科、耳鼻喉科、皮膚科等方面開辟了新的應用領域。麥角生物堿早在 20 世紀 60 年代就已通過生物發酵工程成功生產。
I.形態特征
麥角菌為略呈三棱形的圓柱狀或角狀,稍彎曲,兩端漸尖,其大小因寄主植物而異。國內從黑麥上接種麥角,長約2-4cm,寬約0.2-0.5cm寬,表面紫褐色或黑褐色,有多條縱向裂紋,幹燥時硬、脆易折斷,斷面光滑,略呈三角形,外層黑褐色,內層近白色或爐灰色,子葉由菌核長出,子葉柄細長,多彎曲,白色至黑褐色,子葉柄細長,多彎曲,多彎曲,白色至黑褐色。子葉從核中長出,子葉柄細長,彎曲,白色至黑褐色,頂端的子葉頭近似球形,其大小隨核的大小而變化。壹般直徑約1-3毫米,紅褐色;顯微鏡下觀察到埋在頭部的升孢子殼為壹個整體,孔口稍突出,燒瓶狀,有多數升孢子,每個升孢子有8個升孢子,絲狀,單細胞,無色透明, 50-70×0.6-0.7 μm(圖21-4)。
圖 21-4 麥角的形態圖
1.麥角上生出的麥角仁 2.麥角仁發芽產生出升孢子 3.升孢子外殼(內含升孢子) 4.腹孢子頭部的縱切面(顯示腹孢子外殼)
二、生物學特性
(壹)生長發育及其對環境條件的要求
由於麥角菌是麥角真菌寄生在禾本科植物子房上形成的真菌。由於麥角菌是在植物子房上形成的菌核,因此麥角菌不僅需要高溫高濕才能發育良好,還需要大量的菌源,以及大量的寄主和適合寄主生長的溫度、濕度和土壤等條件。
春夏季雨水充沛,有利於麥角菌的傳播、發展和寄主植物的生長。適合寄主生長發育的土壤條件,也有利於麥角菌核的生長和增產。
(2)黑麥的生物學特性及其與麥角菌接種栽培的關系
黑麥分春黑麥和冬黑麥兩種,屬異花授粉植物。黑麥抽穗揚花期長,花期可達 15 天左右。黑麥分蘗力強,壹般有效分蘗數為 4-6 莖,但在適宜條件下可產生 50 多莖。黑麥不耐高溫,種子在 1-2 ℃ 下即可發芽,對早春幹旱和寒冷有較強的抗性。黑麥對土壤條件要求不嚴,但在肥沃的黑鈣土和適宜的條件下也能獲得高產。黑麥主要在白天開花,很少在夜間開花,壹次或間隔開花,每朵花開 1-5 朵。清晨 5-6 點鐘開始開花,中午前開放較多,下午較少。如果刺激穗狀花序,可以促進其開花。壹般來說,溫度在 17-18℃ 時開花最多。因此,最適宜的接種時間是下午 7-11 點鐘。黑麥開花有壹定的順序,穗的中上部先開花,然後向兩端延伸。根據 Abe 和 Hatta(1949 年)的觀察,黑麥第壹次開花後約兩天,然後開第二次花,花期可長達五天。開花時,麥角菌只能通過柱頭侵入形成菌核。在黑麥開花和麥角形成期間,需要潮濕、溫暖的環境。在此期間,尤其是在接種時,低溫、霜凍、幹燥、暴風雨和寄主植物的倒伏都不利於麥角菌的發育,例如,幹燥、炎熱的天氣會導致花期迅速結束,不利於侵染。花期降雨會延長花期,影響感染率,但影響程度因接種方法和接種期而異。如果采用噴灑接種,接種後立即降雨,感染率會大大降低;如果采用註射接種,則影響不大。土壤含水量和肥沃程度對麥角菌的發生和重量有壹定影響。壹般在濕度大的地方,麥角菌容易侵染,土壤肥沃的地方產生的麥角菌重量較大。
三、栽培技術
麥角菌核中含有具有藥用價值的麥角生物堿,因此早在50年代國外就已通過人工接種栽培成功。如匈牙利自1957年起,每年都種植2000公頃黑麥用於接種栽培麥角,年產麥角達30t左右。我國在 20 世紀 50 年代末人工接種栽培麥角獲得成功。但由於在進行人工接種栽培麥角研究的同時,進行了發酵培養麥角菌生物合成麥角生物堿的研究,後來也獲得成功,所以人工接種栽培技術在我國壹直沒有得到推廣,而是在1962年和1966年分別推廣了固體和液體發酵麥角新生物堿的方法生產麥角。這種方法不僅生產周期短,而且可以有計劃地進行工業化生產,其產量和質量都能得到保證,從而不僅扭轉了依賴進口的局面,而且少量出口,具有很高的社會效益和經濟效益。
(壹)黑麥栽培技術
1、整地
在秋收後第壹年即可進行整地,要求做到早中耕、深中耕。耕後不必耙地,這樣更有利於冬季積雪。但播種前需耙平,做成畦或壟,以備播種。
2.施肥
結合整地施基肥,每畝可施廄肥或土雜肥3000kg。為了獲得麥角的高產,在黑麥生長期間仍需施2-3次追肥。
3、播種
壹般應選擇莖稈和穗直立、矮稈、早熟、分蘗力強,特別是抗銹病能力強的黑麥品種。播種前應先將種子清洗幹凈,剔除混入的雜草種子或其他混合物,選擇整齊壹致、飽滿的種子播種。冬黑麥在秋季溫暖地區可稍晚播種,在秋季寒冷地區早播容易因生長過旺而遭受凍害,或造成翌年發育不良。如果播種過晚,秋季就不能很好地生長和分蘗,因而產量較低。在北京地區,冬黑麥可在 9 月中旬或下旬播種。春黑麥的播種期以 3 月上旬為宜。播種量為每畝 4-6 公斤,壹般認為稀播較好,可促進分蘗。為便於人工播種,可采用條播法。播種深度為 2-3cm。
4、田間管理
生長期間應註意防除田間雜草,疏松土壤,壹般可中耕 2-3 次,當黑麥處於開花結果期時,應盡量保持溫暖濕潤的條件。
(二)麥角接種栽培技術
1.菌種的選擇
優良菌種的選擇對提高麥角產量和麥角堿含量極為重要。選擇優良品種時,應從產堿能力強弱、產堿類型、生長速度、產孢數量、寄生能力強弱等方面綜合考慮。而堿含量和寄生性是關鍵問題之壹。
2.菌種的分離和培養
選擇麥角生物堿含量高的菌核用於母種分離。具體分離方法:將菌核在無菌條件下切成小段,用0.1%的氯化汞水溶液消毒3-5分鐘,再用無菌水沖洗3次,用接種針移入馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養基中,置於24-26℃下培養10天左右,即可長出白色菌絲,這時即可展開純化培養。待菌絲長滿試管後,如不及時使用,可存放在 4-5 ℃冰箱中備用。
3.接種物的制備
壹般采用分生孢子或菌絲接種。麥角菌在斜面培養基或黑麥、小麥培養基上,經過壹定時間培養產生分生孢子和菌絲後,可少量培養用麥芽汁瓊脂培養基進行培養。如果需要大量的分生孢子,可以使用黑麥或小麥種子培養基。具體方法是稱取幹凈的黑麥或小麥種子50g,盛於克氏培養瓶中,加水80ml,浸泡12小時,使麥粒充分吸水,在121℃高溫下滅菌40分鐘,然後間歇換菌壹次。冷卻後,在無菌條件下接入麥角菌種,在26-28℃培養10-15天即可產生大量分生孢子和菌絲。將上述麥角菌培養液加入適量蒸餾水中,浸泡 5-6 小時,劇烈搖晃或攪拌後用壹層紗布過濾。為了防止接種物中的分生孢子迅速死亡,並使其能夠引誘昆蟲,在接種物中加入 2%的蔗糖。接種體中的分生孢子數應約為每毫升 9000 個。
4、接種
麥角壹般侵染子房,接種可在黑麥開花前後1-2周左右獲得麥角。接種技術是麥角菌在寄主植物上接種成功與否的重要環節之壹。主要有以下兩種方法:
(1)註射接種法
壹般小規模試驗采用註射器裝入接種體,在開花或即將開花的小穗上註射。在大規模生產中,采用註射接種板,將孢子液註入花朵部分。這種方法在歐洲國家的麥角栽培生產中得到廣泛應用。
(2)噴霧接種法
這是壹種接近自然侵染的方法。即在黑麥開花時,用噴霧器噴灑孢子懸浮液。這種方法不會對花穗造成任何損害,但受自然條件的影響很大。美國、日本、印度和其他國家都采用這種方法。也有機械化噴霧接種的方法。
還有浸漬法和塗抹法,但壹般寄生率較低,故不常用。
(三)收獲與貯藏
1.收獲
由於麥角成熟時易從麥穗上脫落,所以麥粒收獲時,麥角脫落損失較多,必須提早收獲。壹般在麥粒成熟前1-2周,每周可采摘成熟麥角2-3次。也可采用比重法(利用麥角和黑麥種子比重的差異),以節省時間。在捷克斯洛伐克等國家,主要使用麥角收割機進行清場。在北京,收獲期壹般為 6 月中旬至 7 月上旬,哈爾濱可在 8 月上旬進行。
二、貯藏
麥角采收後,應迅速置於陰涼、幹燥處,以免麥角生物堿破壞貯存。
四、麥角堿的發酵生產由於采用接種栽培麥角的寄主植物來生產麥角堿,往往受到自然條件等的限制,不能在短時間內大量生產,而且需要大面積的農田,成本也較高。發酵法生產麥角生物堿是克服這些困難和不足的壹種方法。幾十年來,許多國家都致力於這方面的研究。自 1948 年以來,利用麥角菌發酵生產麥角生物堿的研究很多,也取得了壹些成果。我國於50年代末60年代初在世界上首次分別用固體發酵和液體發酵法生產麥角新生物堿獲得成功。
(壹)液體發酵法生產麥角生物堿 1.工藝過濾,采用離子交換樹脂法提取分離麥角生物堿→制成麥角生物堿馬來酸鹽順丁烯二酸鹽。
2.菌株
我國麥角新堿生產所用的菌株是威士忌茅麥角[Claviceps microcephala (Wallr.) Tuk],因此細菌中麥角堿含量較高,該菌株是迄今為止我國唯壹主要的麥角新堿高產菌株。
3.培養基
(1)孢子培養基:蔗糖10%,天門冬氨酸0.1%,MgSO4-7H2O 0.03%,KH2PO40.1%,瓊脂2%,蒸餾水,pH用5%NaOH調至6.0-6.2;(2)種子培養基:蔗糖6%,谷氨酸1.2%(或魚粉 4%),MgSO4-7H2O 0.03%,KH2PO4 0.1%,消泡劑(大豆油)0.2-0.5%,自來水,用 25-27%NH4OH 調節 pH 值至 7.5。
4、培養方法
(1)孢子培養:在 24-26℃ 條件下培養 15 天左右備用。(2)種子培養:壹級種子用 500 毫升三角瓶培養,加入 100 毫升種子培養基,接種後在 24-26℃ 旋轉振蕩器上培養約 96 小時。二級種子以5000ml三角瓶裝1000ml種子培養基,在24-26℃往返振蕩床上培養72小時左右,種子罐種子培養,25-27℃攪拌培養3天左右,備用。(3)發酵培養:生產發酵罐通氣攪拌培養,在 25-27 ℃,轉速 180 轉,通氣量為 1:0.3-1:0.5(V/V/min),培養 9-10 天,出罐,過濾。濾液經分離後,用離子交換樹脂法提取麥角新生物。
(二)固體發酵生產麥角生物堿法
1.工藝流程
粉碎提取分離麥角生物堿。
2.菌種
種植孢子培養基、種子培養基及其培養物與原液培養物相同。
3、固體發酵培養基的制作
在500ml克氏瓶中加入麥種50g,自來水80ml,浸泡6-12小時,搖勻,在1kg/cm2壓力下滅菌1小時,趁熱搖勻,備用。
4.發酵培養
將種子接入固體發酵培養基上,每瓶10ml,接種後壹定要搖勻,使菌絲充分生長。15天左右菌絲長出;逐漸形成色素沈澱,22天出現紫褐色,即已達到成熟期,此時即可采收。
5.麥角生物堿的分離提取及順丁烯二酸鹽的制備
(1)矽藻土層析柱的制備
取適量矽藻土,加入適量0.1M檸檬酸飽和氯仿溶液,攪拌均勻成懸浮液。然後慢慢滴入相當於 0.1M 檸檬酸飽和氯仿溶液重量的矽藻土,並不斷攪拌。最後,將細小的矽藻土懸浮顆粒分次裝入圓筒中,每倒入壹點,就用扁平的玻璃棒將其壓平。全部裝入後,再裝入少量氧化鋁即可。
(2)麥角生物堿的分離提取
取風幹的發酵粉,用0.2N氫氧化鈉溶液濕潤後,放入重濾芯中,再加入甲醇和氯仿(5:95)混合液,即開始重濾。滲濾液通過矽藻土層離開濾柱,部分雜質如色素被吸附在氧化鋁層上,而麥角生物堿被吸附在矽藻土上,在紫外燈下形成藍色熒光環,其他非水溶性生物堿和部分雜質隨甲醇氯仿溶液壹起流入蒸餾器,甲醇氯仿混合物遇熱變成蒸汽,通過冷凝器流回濾芯。如此循環往復,直至發酵物中的麥角生物堿全部提取出來為止。
(3)順丁烯二酸麥角生物堿的制備
萃取完成後,除去矽藻土柱中的氧化鋁,用中性氯仿洗滌矽藻土柱,直至氯仿無色流出。然後用含 1%液氨的氯仿洗脫矽藻土層析柱中的麥角新堿。洗脫液用無水碳酸鈉脫水,減壓蒸發氯仿析出晶體。將晶體溶於適量丙酮中,滴加過量的3%馬來酸丙酮溶液,析出白色針狀晶體,即為麥角生物堿馬來酸鹽。
(4)麥角新堿制劑
臨床應用的制劑主要是0.2mg麥角新堿馬來酸鹽註射液和片劑。
我國對麥角的栽培研究始於1957年,兩年內選育出優良品種和寄主,並建立了壹套栽培技術,在北京用接種板進行接種,每畝可收獲10.5kg(相當於畝產63kg),達到較高水平。選育出的優良品種產生的麥角堿含量為 0.22%-0.4%。其中,新麥角堿含量為0.122-0.29%,遠優於國外栽培的麥角。
栽培麥角的研究為麥角新堿的發酵生產提供了線索,從而發展了固體發酵的研究,所選菌株經22天培養,堿含量高達0.08-0.1%,其中麥角新堿為0.02-0.03%。此後,液體發酵也獲得成功,發酵周期縮短為 9 天,其產堿量與固體發酵差別不大。
從大規模生產麥角生物堿的角度來看,液體發酵最有前途。