1996年，美國應用生物系統公司（Applied Biosystems Inc.）首先推出了實時定量聚合酶鏈反應（Real-time qPCR）。所謂實時qPCR，是指在PCR反應中加入熒光基團，通過連續監測熒光信號的序列以及信號強度的變化，即時分析目標基因的初始量。所謂實時 qPCR，是指在 PCR 反應中加入熒光基團，通過連續監測熒光信號的序列以及信號強度的變化，即時分析目標基因的初始量，該技術的發明實現了 PCR 從定性到定量的飛躍。
熒光化學試劑
目前，根據實時 qPCR 使用的熒光化學試劑不同，可分為熒光染料和熒光探針兩類。
熒光染料
熒光染料又稱 DNA 結合染料，主要使用的染料分子是 SYBR Green I。SYBR Green I 能與 DNA 雙鏈的小溝特異性結合，遊離的 SYBR Green I 幾乎沒有熒光信號，但當它與雙鏈 DNA 結合後，其熒光信號可增加數百倍。與染料結合的 PCR 產物量隨著 PCR 產物的增加而增加，其熒光信號的強度代表了雙鏈 DNA 分子的數量。
熒光染料的優點：
使用方便；
可與任何 PCR 產物結合；
價格便宜；
熒光染料的缺點：
不能區分不同的雙鏈 DNA
二聚體會影響檢測的靈敏度
非特異性產物會影響結果的靈敏度
二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔融曲線來識別？這可以通過設計 PCR 引物和優化反應條件來確定和解決。
總的來說，SYBR Green I 方法是最基本、最常用的實時 qPCR 實驗之壹。
熒光探針
Real-time qPCR 中最常用的熒光探針是 TaqMan 探針，其基本原理是設計合成能與目的基因特異性雜交的探針，探針的 5' 端標記熒光基團，3' 端標記淬滅基團。
正常情況下，兩個基團之間的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發出熒光。
進行 PCR 擴增時，引物和探針同時與模板結合，探針的結合位置位於引物的上遊和下遊之間。
當擴增延伸到探針結合位置時，Taq 酶利用 5' 外切酶的活性將連接在探針 5' 端的熒光分子從探針上切下，從而使探針發出熒光。檢測到的熒光分子數量與 PCR 產物的數量成正比，因此可以根據 PCR 反應體系中的熒光強度計算出初始 DNA 模板的數量。
TaqMan探針技術解決了熒光染料與非特異性擴增結合的問題，而且無需在反應結束時通過熔解曲線進行檢測，從而縮短了實驗時間。
TaqMan探針技術的優點：
熒光背景低；
靈敏度高；
雜交穩定性高；
熒光光譜分辨率高；
特異性高。
TaqMan探針技術的缺點：
成本高；
設計困難；
只能用於檢測產物長度低於150 bp的反應。
由於 TaqMan 探針具有高度特異性，因此可用於等位基因的鑒別，特別是人類基因多態性的鑒別，以及根據 SNPs 區分和量化菌株。
實時 qPCR 定量
擴增曲線
在實時 qPCR 中，整個 PCR 反應擴增過程都是實時檢測並記錄熒光信號，隨著反應的進行，監測到的熒光信號可繪制成壹條曲線，即擴增曲線。
熒光放大曲線壹般分為基線期、指數增長期和高原期。
在實時 qPCR 擴增的早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化，這就是基線期。
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數呈指數增長，隨著反應循環次數的增加，PCR反應最終停止以指數方式產生模板，從而進入 "高原期"。在這壹時期，擴增產物不再呈指數增長，最終 PCR 產物的量與起始模板的量之間不存在線性關系，因此無法根據最終 PCR 產物的量計算出初始模板的量。
只有在熒光信號的指數增長期，PCR 產物量的對數值與起始模板量之間才存在線性關系，您可以選擇在這壹階段進行定量分析。
熒光閾值
為了便於對檢測到的樣品進行比較，需要設置壹個熒光信號閾值，熒光閾值是在擴增曲線上人為設置的壹個值，可以設置在指數擴增階段的任意位置，壹般熒光閾值設置為 3-15 個循環熒光信號標準偏差的 10 倍，但實際應用中要結合擴增效率、線性回歸系數等參數進行定量分析。
壹般情況下，熒光閾值設定為 3-15 個循環熒光信號標準偏差的 10 倍，但實際應用中應結合擴增效率、線性回歸系數等參數進行綜合考慮。
通常情況下，熒光閾值由實時 qPCR 儀器自動設置，如無特殊情況，無需更改。
循環閾值閥
循環閾值閥（Ct）？是指在實時 qPCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值的擴增循環次數，Ct 值與熒光閾值有關。
壹般情況下，Ct 值位於指數增長期的開始階段，此時樣本間的微小差異尚未被擴增，擴增效率相對恒定，因此 Ct 值具有極好的重現性，盡管 DNA 拷貝數在高原期波動較大，但 Ct 值相對固定。