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Tdr藥物

教學目的

1.掌握粗DNA的提取和鑒定方法。

2.觀察提取的DNA物質。

二,教學建議

在本實驗的教學中,教師應註意以下幾點。

1.實驗材料壹定要準備好。本實驗所用的實驗材料是雞血細胞液,是由活雞血沈澱得到的。每組(2名學生)需要5 mL的雞血細胞,那麽每節課(50人)至少需要130 mL,而雞血細胞與雞血的體積比為1:3,那麽每節課至少需要390 mL的雞血細胞。殺1中型活雞壹般能得到120 mL左右的血,所以1班需要買4只活雞。如果沒有條件買活雞,也可以到賣活雞的市場要雞血,但壹定要提前在燒杯裏放抗凝血劑。

2.用於雞血細胞液體的容器,優選塑料容器。雞血細胞破碎後釋放的DNA很容易被玻璃容器吸附。因為細胞中DNA的含量已經比較少了,如果用玻璃容器吸附壹部分,提取的DNA就更少了。所以實驗時最好使用塑料燒杯和試管,這樣可以減少DNA在提取過程中的損失。

3.獲得更純DNA的關鍵步驟。

(1)充分攪拌的雞血細胞液DNA存在於雞血細胞的細胞核中。雞血細胞溶液與蒸餾水混合後,必須用玻璃棒朝壹個方向快速攪拌,以加速雞血細胞的破裂,釋放DNA。

(DNA沈澱必須用冷酒精。實驗前,必須準備大量95%的酒精,並在冰箱中保存(至少5秒鐘)至少24小時。

(3)適當攪拌含有懸浮物的溶液。實驗步驟3、5、7都需要用玻璃棒攪拌。老師要提醒學生,在第3步和第5步中,玻璃棒不要直接插入燒杯底部,攪拌要輕柔,以便獲得更完整的DNA分子。在步驟7中,將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢旋轉510分鐘。

3.參考資料

實驗原理補充介紹

1的釋放DNA。DNA位於雞血細胞的細胞核內,正常情況下不會釋放。為了從細胞核中釋放DNA,將蒸餾水加入到雞血細胞液體中並攪拌。蒸餾水對雞血細胞來說是壹種低滲液體,大量的水會進入血細胞,導致血細胞破裂。同時再加上攪拌的機械作用,加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂),從而釋放出DNA,當然還有RNA。然而,大量釋放的DNA和RNA往往與蛋白質結合。

2.DNA和蛋白質的分離是基於它們的特性,即在高濃度的氯化鈉溶液中(物質的摩爾濃度為2 moL/L),核蛋白容易解聚解離DNA。而d Na在高濃度氯化鈉溶液中的溶解度很高,Na+與帶負電荷的DNA結合形成DNA鈉鹽。此時,DNA溶解在溶液中。

3.DNA的分離與獲取基於DNA在低濃度氯化鈉溶液中溶解度低的原理,在含有DNA的高濃度氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水(300 mL),稀釋氯化鈉溶液,使DNA的溶解度降低,而蛋白質的溶解度增加(這是鹽溶於蛋白質的現象),從而將兩者分離。此時,在不斷的攪拌下,溶解度下降的DNA逐漸變得絲滑。過濾後可以去除蛋白質,得到DNA的粘性物質。如果離心法則更好,以4 000 r/min的轉速離心65±438±0.5min,去除上清液(含蛋白質),留下含DNA的沈澱。

4.重新溶解DNA,然後用更高濃度的氯化鈉溶液溶解DNA粘性物質。

5.5的沈澱和濃度。DNA去除了蛋白質的核酸溶液,所以必須進壹步沈澱濃縮。最常用的方法是醇沈法。也就是說,將含有Na+的DNA溶液加入到兩倍於其體積的95%冷酒精溶液中。混合後,DNA可以沈澱並濃縮,形成雜質較少的DNA絲,懸浮在溶液中。如果細絲很少,可以將這種混合物放入冰箱冷卻幾分鐘。慢慢轉動玻璃棒(因為玻璃棒有吸附DNA的功能),可以把濃縮的DNA絲卷起來。

6.DNA的鑒定本實驗的DNA鑒定方法為二苯胺法(配方見下文“藥物制備”)。二苯胺法的原理是DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖與酸反應生成ω-羥基-γ酮戊醛,與二苯胺反應呈現藍色(溶液為淺藍色)。

鑒定時溶液的藍色與溶液中的DNA含量有關。

二苯胺試劑的制備

溶液A:將15 g二苯胺溶解在100 mL冰醋酸中,然後加入15 mL濃硫酸,儲存在棕色瓶中。如果冰醋酸是結晶狀態,使用前需要加熱融化。

溶液B: 0.2%體積的乙醛。

制備:將0.1毫升溶液B加入10毫升溶液A中,即可使用。

DNA粗提和鑒定的另壹種方法

1.材料和器具

新鮮的花椰菜(或大蒜和菠菜)。

塑料燒杯、量筒、玻璃棒、尼龍紗布、陶瓷砂漿、試管、試管架、試管夾、漏鬥、酒精燈、石棉網、三腳架、火柴、刀片、天平。

研磨液、體積比為95%的酒精溶液、二苯胺試劑和蒸餾水。

2.方法步驟

(1)DNA的粗提取

①準備材料將新鮮的花菜和95%的酒精溶液放入冷凍室至少24小時。

②稱取30 g菜花,去莖取花,切碎。

③研磨:將切碎的菜花放入研缽中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min。

(4)過濾,在漏鬥中放入尼龍紗布,將菜花研磨液過濾至燒杯中(有條件的學校可將濾液倒入塑料離心管中離心,以1 000r/min的轉速離心25 min,取上清液放入燒杯中)。放入4℃冰箱冷藏幾分鐘,然後取上清液。

⑤加入冷酒精。將1體積上清液倒入2體積95%冷酒精溶液中,用玻璃棒緩慢輕輕攪拌溶液(不要將玻璃棒直接插入燒杯底部)。沈澱35分鐘後,出現白色DNA絮凝物。慢慢旋轉玻璃棒,絮狀物會纏繞在玻璃棒上。

(2)DNA的鑒定

①準備二苯胺試劑。取0.1毫升溶液B,滴入1毫升溶液A中,混勻。

②鑒別:將4 mL DNA提取液置於試管中,加入4mL二苯胺試劑,混合後觀察溶液顏色(非藍色)。在沸水浴(100℃)中加熱10分鐘。加熱過程中,要時刻註意試管內溶液的顏色變化(逐漸出現淺藍色)。

壹種研磨液的制備方法

Tris: 10.1 g(相對分子量:121.14),先溶於50毫升蒸餾水中,用2摩爾/升鹽酸調至pH8.0,再加入下列藥物。

氯化鈉:8.76克(分子量58.44)

乙二胺四乙酸:37.2克(分子量372.24)

十二烷基硫酸鈉:20克(分子量288.3)

上述藥物全部溶解後,用蒸餾水定容至1 000 mL。

如果藥液在低於20℃的室溫下配制,SDS會沈澱出來。此時需要加熱溶解SDS。如果事先配好的漿料有沈澱,使用前應加熱溶解沈澱。

幾種藥物在磨削液中的作用

SDS(十二烷基磺酸鈉):蛋白質可以變性,與DNA分離。

EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)是脫氧核糖核酸酶的抑制劑,能阻止脫氧核糖核酸酶在細胞破碎後降解DNA。

濃度為0.1.5 mol/L: DNA的氯化鈉溶液能很好的溶解。

Tris/HCl:提供壹個緩沖系統,DNA在其中處於穩定狀態。(Tris是三羥甲基氨基甲烷)

DNA鑒定的其他方法紫外燈照射法對DNA鑒定非常有效。具體鑒定方法如下。

1.準備染料。用蒸餾水制備萬分之五的溴化乙錠(EB)溶液。

2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物擦拭在蠟紙上,然後用1滴EB溶液染色。

3.蠟紙用紫外燈(260 nm)(暗室)照射時,可見橙紅色熒光(DNA的紫外吸收峰在280 nm)。

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