取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、修補、染色、透明、封片等步驟。
具體來說:
1.取材
取材的好壞直接影響切片的質量,無論取何種動物或植物材料,都必須註意以下幾點。
(1)植物材料必須盡可能選擇不損傷植物體或所需部位的材料;動物材料常采用麻醉動物,常用的麻醉劑有氯仿和乙醚,否則會將動物殺死後迅速取出所需組織。
(2)材料必須新鮮,這對細胞生物學研究尤為重要,應盡可能切取活體組織塊,並立即放入固定液中。
(3)切割材料時刀子要鋒利,以免擠壓細胞造成損傷。
(4)切割的材料應小而薄,以利於固定液迅速滲入內部。壹般厚度不超過2mm,大小不超過5×5mm2.
2.固定
組織和細胞離開人體後,在壹定時間內仍繼續生命活動,會引起病理變化直至死亡。為了使標本能反映其正常的生命狀態,就必須盡早用壹定的化學藥品迅速殺死組織和細胞,抑制上述變化,並將結構成分轉化為不溶性物質,防止某些結構的溶解和消失。這種處理方法就是固定。除上述作用外,固定劑還能使組織適當變硬,便於後續處理,改變細胞內部的折射系數,使某些部位易於染色。
固定劑主要作用於蛋白質;其他成分,如脂肪和糖類,在壹般制備過程中不考慮在內,如果要觀察這些物質,可采用特殊方法固定。
3.脫水
生物組織中含有大量的水分,它與石蠟不相溶,導致包埋時石蠟不能滲入組織中,所以要用脫水劑除去水分,這就是脫水的作用。
脫水劑必須能與水以任何比例混合。脫水劑有兩類:壹類是非石蠟性溶劑,如乙醇、丙酮等,脫水後必須透明才能包埋蠟;另壹類是部分石蠟性溶劑,如正丁醇,脫水後可直接滲入蠟中。
常用的脫水劑是乙醇,因為它便宜易得。
4.透明
用非石蠟類溶劑脫水後的組織塊必須透明。透明劑可同時與脫水劑和石蠟混合,它取代了脫水劑,石蠟就能順利滲入組織。
透明劑的種類很多,比較常用的有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、杉木油、苯胺油等。
5.透明蠟和包埋
透明蠟應在恒溫箱中進行,恒溫箱的溫度調至石蠟熔點以上3度,這樣透明後的組織塊才能用石蠟和二甲苯等量混合,進行純石蠟處理。
透明的關鍵是控制溫度恒定,不要忽高忽低,溫度過低,石蠟不能滲透凝固,溫度過高使組織收縮變脆。
包埋就是將浸蠟組織塊用石蠟包好。具體做法是;先準備好紙盒(具體折疊方法見圖1-3及說明),將熔化的蠟倒入盒中,迅速用事先預熱好的鑷子夾起組織塊平放在紙盒底部,切面朝下,然後輕輕提起紙盒,平放在冷水中,待表面的石蠟凝固後立即將紙盒壓入水中,使其迅速冷卻凝固,30min後取出。
包埋用蠟的溫度應略高於透氣蠟的溫度,以保證組織塊與周圍的石蠟完全融合在壹起。石蠟的快速冷卻也很重要,否則包埋塊中會出現結晶。這將導致稍後切片時出現碎裂。
6.切片
切片前,將切刀置於放大鏡下,選擇切刀平整、無缺陷的部分進行切割。將待切割的嵌入塊固定在試樣臺上,使嵌入塊的外切割面與試樣夾的橫截面平行,並使嵌入塊略微外露。將刀臺推至外緣,然後松開刀片夾的螺釘,裝上刀片,使切片刀平面與組織切面之間有約 15°的夾角,且包埋塊的上下邊緣與刀平行。在微操作裝置上調整切片所需的厚度。調整時應註意,指針不能位於兩個刻度之間,否則容易損壞切片機。將刀臺移至標本臺附近,使刀刃與組織切面稍有接觸。方法是右手轉動轉輪,左手持毛刷在刀稍下端切三文治片,並握住切好的蠟帶,待蠟帶形成壹定長度後,右手停止轉動,持另壹毛刷輕輕拾起蠟帶,平放在襯有黑紙的紙盒上、註意切片速度不宜過快,搖輪時用力要均勻,防止機器振動造成切片厚薄不均,還應註意旋轉方向,以防試樣臺後退,防止損壞切片機。同時還應註意旋轉方向,防止試樣臺後移而切不出切片。切片後,應及時用氯仿將切片機的相關部位擦拭幹凈。