壹、主要材料
尿激酶粗品(矽膠法生產)，甘氨酸(C·P)、硫酸(A·R)、氫氧化鈉(A·R)、鹽酸
(A·R)、磷酸二氫鈉(C·P)、磷酸氫二鈉，疊氮化鈉(A·R)，714樹脂，CM壹S。
二、試驗過程與技術條件
(壹)解析
1.取尿激酶粗品200克(經測定，比活為325iu/mgP)，懸浮於8倍量的。.SM甘氨酸緩沖液中，尿激酶濃度在45ooiu/ml，維持低溫，攪拌75分鐘，靜置45分鐘，上清液經虹吸與底部沈澱分開。
2.虹吸上清液後的沈澱加入1倍量的甘氨酸緩沖液，處理同上，取上清液.
3.合並兩次上清液，在低溫下緩慢加入SNH:50.調PHlo.。士。.1(取樣測定價).
(二)714樹脂脫色
1.按解析液效價每億單位用1.4kg樹脂上柱，樹脂用蒸餾水洗幾個床體積後備用。
2.將PH10·。的解析液上柱，流速控制在1.8~2.oml/cmZ分，收集流出液，上柱完畢後，，柱用壹個床體積的低溫蒸餾水洗滌.
3.合並柱流出液用sNHZSO‘調PH為10.0士0.1.
(三)超濾處理
1.將PH為10.。的脫色液用超濾器超濾脫鹽，超濾濃縮至原體積的六分之壹左右。
2.濃縮液中加入低溫蒸餾水，稀釋至電導4.smV(10℃)。
3.再次濃縮至六分之壹體積。
4.二次濃縮液中加人低溫。.18M、PH6.8磷酸緩沖液及蒸餾水稀釋至原體積，二者加入的比例應使稀釋液電導為4.8士0.lmV(10℃時)。
5.再用SNHZSO.調PH為6.8士0.1。
6.再次校正電導為4.8士。.lmV(10℃)。
(四)CM壹S交換凝膠純化(在低溫下進行)
1.CM壹S預處理:CM壹S用燕餾水浸泡後，分別用Na0H和HCL處理，然後用0.18M、
PH6.8磷酸緩沖液平衡，過濾;平衡過的CM壹S懸浮於含0.08%NaN:，0.18M、PH6.8磷酸緩沖液中，低溫冷藏。
2.CM壹S吸附
(1)經超濾PH6.8電導4.smV的尿激酸溶液，按skg/億單位加入經平衡的CM壹S，攪
拌兩小時，防止起泡，靜置壹小時，虹吸去除上清液。
(2)吸附尿激酶的CM壹S上有機玻璃柱，防止柱內起泡，柱面平整.
3.洗滌去除雜蛋白
(1)CM壹S上柱後用含0.3%NaN3，PH6.8、0.18M磷酸緩沖液洗滌，流速為1.8~
2.。而/cmZ分左右，流至流出液效價低於10oiu/耐，28onm光吸收峰低於。.04E/已。
(2)改用1.SMPH6.8磷酸緩沖液洗滌壹個半床體積，流速不變，流出液280nm吸收峰應降至0.03以下。
4.尿激酸洗脫
(1)洗滌完畢後用0.08MP、H8.8磷酸氫二鈉、0.95M氛化鈉緩沖液洗脫，流速。.4ml/cmZ分，測定流出液效價及280nm吸收峰，將有活力流出液合並，使混合液濃度在S000in/ml以上。
(2)混合液調PH6.。~7.0.抽取試樣化驗後，裝於二升的塑料瓶內，幹冰速凍，壹22℃以下低溫保存。
(五)尿激酸〔UK)效價和比活的測定
1.測試原理
(1)主要試劑與器材
恒溫水浴鍋、刻度鬧鐘、熒光燈、UK效價坐標紙、牛凝血酶(T)、牛纖維蛋白溶酶原(PG)、牛纖維蛋白(FG)、UK標準品、Barbiton壹Na，Tri。，NaZEDTA，Nael
(2)試劑配制
T:牛凝血酶40BP(衛生部藥品生物制品檢驗所)，每支加6.6mlBarbiton壹Na緩沖液。
PG:牛纖維蛋白溶酶原22BP(衛生部藥品生物制品檢驗所)，每支加24mlTris緩沖液。
PG壹T:取PG6.6nil與配好的6.耐T等體積混勻，放入50血三角燒瓶中，紮口備用。
FG:片纖維蛋白原，12sBP(衛生部藥品生物制品檢驗所)，每支加18mlBarbiton壹Na
緩沖液。
(3)標準UK稀釋
將標準品(loooiu/支)用巴比妥溶液稀釋成60in/ml。
(4)繪制標準曲線
①取5時試管4支，作記號並分別加入FGO.3耐;
②分別加入稀釋標準UK溶液0.4、0.3、0.2、0.lm蔔
③分別加巴比妥溶液0.6、0.7、0.3、0.9回;
④分別加入0.4mlPG壹T，搖勻，立即放入37℃恒溫水溶鍋，記時;
⑤觀察氣泡上升情況，體積壹半時記終止時間;
⑥以單位效價為橫坐標，時間為縱坐標，繪制標準曲線，要求至少有三點在壹條直線上。
(5)樣品檢測
①繼標準曲線後，在同壹條件下，同壹試劑情況下，進行樣品檢測;
②分別加FGO.3ml，巴比妥緩沖液0.gml，PG壹TO.4mh
③其余步驟同前。
(6)測O.D值
將加酸後的樣品稀釋10倍，然後測其O·D值。
(7)計算效價與比活
①根據測試樣品的氣泡上升時間，在標準曲線上找出相應的點的效價，乘以20得出樣品
實際效價。
②總效價~單位效價(iu/mDx總體積(ml)
③比活~平均效價xl.75/0·D
2.對產品收率和比活的測定
①對解析液進行總效價和比活測定，結果如下:
總效價:2489萬單位，比活:325iu/mgP
②精制後總效價和比活
總效價:1082萬單位;比活:”660iu/mgP
③精制收率:41%
三、討論
1.尿激酶通常以兩種分子形式存在，即分子量36。。。和54000，大分子量的尿激酶活性
較小分子量尿激酶活性強得多，提高比活，壹是要去除雜蛋白，二是要除去小分子量尿激酶。
分離出的小分子量尿激酶可以另作回收純化處理。
2.尿激酶作為壹種活性物質，在純化過程中要註意防止失活。我們在研究過程中，先是
熟練地掌握尿激酶效價和比活的測定步驟，然後不斷改變操作條件，通過對每壹道工序中影
響尿激酶收率、比活提高因素的研究，逐步摸索出最佳技術條件。
3.對CM壹S吸附後的母液及CM壹S洗脫液中效價大於200iu/ml的部分要進行超濾鹽
析回收，可用作粗品投料。
用於提取尿激酶的男性尿液，其pH值<6.5，電導為20~3OMO壹’，細菌總數<1000
個/ml，用3N氫氧化鈉調pH~8·5壹9.加入矽藻土吸附並沈澱後，濾取矽藻土，用清水攪拌洗滌，甩幹裝入交換柱，用氨水淋洗，在洗脫液中加入飽和磷酸二鈉,調pH=8.0，再加氯化鈉調電導至22Mn，通過季錢乙基，交聯聚糖凝膠層析柱，再用磷酸緩沖液洗脫，合並流出液與洗脫液，加醋酸調pH壹4.2，調電導至16~17Mn壹’，通過甲基纖維素層析柱，用氨水洗脫，收集洗脫液，加水透析，經離心分機冷凍幹燥得到尿激酶成品。上述得到的僅為尿激酶粗品，還可用右旋糖配、肝素、人血清白蛋白等加以修飾精制，以增強其生化穩定性，延長在人體內的作用時間。除用上述分離法制取尿激酶外，還可以采用中性蛋白酶降解的辦法制取尿激酶。國外還有采用DNA重組的辦法，在大腸桿菌中培植尿激酶原。在提取尿激酶的同時還可利用剩余尿液提取人尿白蛋白.
尿激酶屬堿性蛋白酶無抗原性，無毒性和其它副作用，可臨床用於肺栓塞、冠心病、腦血栓、心肌梗塞、玻璃體混濁、眼底出血、顱內血腫、靜脈栓塞以及急
(慢)性腎小球腎炎等疾病的治療，還可用於治療纖維蛋白沈著引起的疾病，並可用作抗癌輔助藥物。此外，尿激酶還可用來開發保健飲料、太空飲料及化妝品等。作為鄉鎮企業，開發尿激酶產品，不僅投資少，效益高，能耗低，且原料易得，工藝簡單，無毒無害無汙染，值得大力提倡.